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La tecnología CRISPR/Cas9 ha mejorado la capacidad de introducir modificaciones dirigidas en células y embriones de diversas especies. Su utilización permite desarrollar modelos de animales de producción modificados genéticamente para estudiar enfermedades humanas o mejorar la producción de alimentos. Sin embargo, una de las principales preocupaciones asociadas al uso de esta tecnología es la posibilidad de introducir modificaciones genómicas no deseadas inducidas por la proteína Cas9 de Streptococcus pyogenes (SpCas9), una de las proteínas Cas9 más utilizadas. Los avances recientes en la tecnología CRISPR/Cas9 han permitido desarrollar variantes de Cas9 diseñadas para mejorar la especificidad de la edición genética.
Objetivo: En este estudio, se emplearon tres variantes de SpCas9 de alta fidelidad (eSpCas9, HiFi Cas9 y LZ3 Cas9) para examinar su eficacia y especificidad en embriones porcinos.
Métodos: Para introducir modificaciones dirigidas, se mezcló el ARN mensajero (ARNm) que codifica cada variante de Cas9 con un ARN guía único (sgRNA) dirigido al gen IGH y se inyectó en cigotos porcinos fecundados. La frecuencia de edición en la secuencia diana y fuera de ella se determinó mediante la amplificación de las regiones IGH, AR y RBFOX1 a partir del ADN genómico obtenido de los embriones inyectados en fase de blastocisto, seguida de secuenciación Sanger.
Resultados: El sgRNA dirigido al locus IGH logró una una tasa de edición del 100% en la secuencia diana utilizando SpCas9. Sin embargo, SpCas9 provocó modificaciones fuera de la secuencia diana en las regiones AR y RBFOX1 con una elevada frecuencia (>60%) en los embriones. La inyección de cada variante de Cas9 a una concentración de 20 ng/µl permitió modificar el gen diana (IGH) con una eficacia del 100%, excepto en el caso de LZ3 Cas9 (59,1%). Cabe destacar que no se detectaron modificaciones fuera de la secuencia diana en AR y RBFOX1 en ninguno de los grupos tratados con las variantes de Cas9. La reducción progresiva de la concentración de ARNm de Cas9 disminuyó la eficacia de la edición en la secuencia diana en todos los grupos, aunque esta reducción fue más acusada en los embriones inyectados con HiFi Cas9 y LZ3 Cas9. No se detectó toxicidad embrionaria en los embriones inyectados con las variantes de Cas9; además, un mayor número de embriones alcanzó la fase de blastocisto cuando se inyectó ARNm de eSpCas9 o HiFi Cas9. La competencia in vivo de los embriones tratados con eSpCas9 se evaluó mediante transferencia embrionaria. Los fetos recuperados de una cerda gestante presentaron una eficacia de edición del 100% en la secuencia diana, sin que se detectaran modificaciones fuera de ella.
Conclusión: En resumen, entre las variantes de Cas9 evaluadas, eSpCas9 presentó la mayor especificidad, sin modificaciones detectables fuera de la secuencia diana, y permitió el desarrollo de fetos con edición genética. Estos hallazgos indican que el uso de variantes de Cas9 puede contribuir al avance de la edición genética en modelos de animales de producción.
Kim J, Yoon J, Chen J, Lee J, Lee HJ, Whitworth K, Redel B, Prather RS, Lee K. Enhancing the specificity of gene editing outcomes by using Cas9 variants in porcine embryos, Journal of Animal Science, Volume 104, 2026, skag030.
https://doi.org/10.1093/jas/skag030
