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El test ELISA como herramienta de diagnóstico (2/2): Interpretando los resultados

Cosas a tener en cuenta cuando interpretamos los resultados positivos o negativos de un test ELISA.

Consideraciones al interpretar los resultados:

  • Los cerdos expuestos a un patógeno (de campo o vacunal) tardan un tiempo en producir suficientes anticuerpos para ser detectados mediante ELISA (normalmente al menos 2-4 semanas tras la exposición, dependiendo del patógeno y el anticuerpo que estemos buscando)
  • Los test ELISA de anticuerpos no pueden diferenciar los anticuerpos maternales (pasivos) de los causados por exposición (activos).
  • Los test ELISA de anticuerpos a menudo no pueden diferenciar los anticuerpos producidos por una vacuna de los producidos frente a una exposición a una cepa de campo.
  • En algunos casos, se pueden desarrollar test ELISA especiales, que permiten diferenciar animales infectados de vacunados (si se usan vacunas DIVA).
  • Los resultados del ELISA de anticuerpos no implican protección. La protección puede proceder de distintos anticuerpos, que no necesariamente son los que se miden en el test, o por inmunidad mediada por células, que es completamente diferente a la inmunidad humoral, o mediada por anticuerpos, y no se mide mediante un test ELISA.
  • El ELISA de antígenos es significativamente menos sensible (baja sensibilidad analítica) al detectar antígenos, comparado con una PCR. La PCR replica activamente el ADN/ARN presente, por lo que puede detectar cantidades extremadamente bajas de virus o bacterias. Por otra parte, el ELISA de antígenos requiere una concentración significativamente mayor de virus o bacterias para ser capaz de crear un cambio de color detectable.
  • Cuando se usan ELISA comerciales (fáciles de encontrar y usar), los resultados son estandarizados y normalmente consistentes entre laboratorios. Los test ELISA creados en el propio laboratorio pueden producir una gran variabilidad de resultados a menos que su protocolo de producción esté muy estandarizado y se siga de forma estricta.
  • No todos los patógenos producen una respuesta inmune que se pueda medir
  • Normalmente cada kit ELISA analizará proteínas diferentes, lo que puede producir resultados muy distintos para la misma muestra. Un claro ejemplo son las grandes diferencias en los kits para detectar anticuerpos frente a Mycoplasma hyopnemoniae; evidentemente, no todos los kits se crean igual.
  • La dosis y/o la ruta de exposición pueden afectar el nivel de la respuesta inmune (nivel de producción de anticuerpos)
  • Es importante conocer la sensibilidad del test (capacidad de detectar verdaderos positivos) y su especificidad (capacidad de identificar los verdaderos negativos como negativos; sin reacciones cruzadas)
  • Los falsos positivos y los falsos negativos se pueden producir porque la cantidad de exposición y la respuesta inmune a los patógenos varía entre cerdos individuales (distribución normal) y a menudo hay reactividad de fondo o cruzada que no puede ser eliminada del todo (ver figura 1)
  • Los anticuerpos suelen seguir presentes/detectables durante varios meses tras la exposición/vacunación

Figura 1. Diagrama que demuestra el punto de corte establecido para un ELISA. La curva azul representa una distribución normal de animales negativos. La curva naranja representa una distribución normal de animales expuestos. Se indica el área para falsos positivos y falsos negativos.

Figura 1. Diagrama que demuestra el punto de corte establecido para un ELISA. La curva azul representa una distribución normal de animales negativos. La curva naranja representa una distribución normal de animales expuestos. Se indica el área para falsos positivos y falsos negativos.

Resultados negativos

  • Muestra/granja realmente negativa al patógeno (sin exposición ni vacuna)
  • El muestreo de la granja es realmente negativo para el patógeno, aunque los animales pueden haber sido vacunados (si el test tiene capacidad DIVA) (sólo en test ELISA de anticuerpos)
  • No hay suficiente antígeno presente en la muestra para su detección (sólo en test ELISA de antígenos)
  • La muestra se ha recogido demasiado pronto y el cerdo todavía no ha sido capaz de generar una respuesta inmune (sólo en test ELISA de anticuerpos)
    • PRRS a menudo requiere 7-10 días para la seroconversión
    • Lawsonia intracellularis a menudo requiere 4-6 semanas para la seroconversión, dependiendo de la dosis de exposición
  • La muestra se ha tomado demasiado tarde y el patógeno ya no está presente
    • El virus de la influenza sólo está presente en secreciones nasales durante los primeros 3-4 días
  • Estamos buscando el anticuerpo/antígeno equivocados
    • Cepas distintas de influenza (diferencias entre H1N1 y H3N3 y también entre distintos clados de H1N1)
  • Baja prevalencia en la granja y el/los animal/es muestreados eran negativos
    • Hay que aumentar el número de animales muestreados
  • Una enfermedad en concreto puede no estimular suficientes anticuerpos para la detección
    • Mycoplasma hyopneumoniae se adhiere principalmente a los cilios pulmonares y no estimula una producción elevada de IgG en suero
      • Una infección de campo reciente produce unos resultados ELISA mucho más potentes
    • Las vacunas frente a Mycoplasma hyopneumoniae no estimulan una respuesta inmune IgG fuerte
      • Distintos tests ELISA detectan las vacunas de modo distinto
      • Normalmente, sólo el 30% de los animales vacunados seroconvierten
  • Una muestra débilmente positiva se diluirá si se agrupa con otras
    • ¡Se recomienda encarecidamente NO agrupar muestras!

Muestra positiva

  • Muestra/granja realmente positiva a la exposición al patógeno
  • Incapaz de diferenciar si la muestra es infecciosa o no infecciosa
  • Incapaz de diferenciar anticuerpos maternales de la exposición natural o la vacunación
    • La mayoría de anticuerpos maternales desaparecen a las 8-12 semanas de vida
    • A medida que los cerdos crecen, los valores de ELISA deberían reducirse significativamente
    • Pueden hacerse tests seriados para confirmar la desaparición de los anticuerpos maternales, así como la falta de exposición a cepas de campo (sin nuevas infecciones)
  • Según qué patógeno buscamos, la detección de la proteína (antígeno/anticuerpo) no siempre confirma la enfermedad
    • El suero que da positivo a circovirus porcino tipo 2 (PCV2) mediante ELISA de anticuerpos, confirma la exposición a PCV2, ya sea mediante vacunación o infección (ambos casos son bastante frecuentes) pero no confirma si el desmedro es atribuible a PCV2 o si se ha producido un fallo vacunal. Hay que hacer inmunohistopatología de pulmón y o de tejido linfoide para demostrar enfermedad asociada a PCV2.
    • Es posible que el test no pueda diferenciar la exposición a virus/bacteria vacunales de una vacuna viva modificada de una infección de campo (sólo el ELISA de anticuerpos)
      • Aplica tanto a vacunas muertas como a vivas modificadas
      • Es útil conocer el momento en que se aplica la vacuna, aunque no es crítico, ya que los animales pueden permanecer positivos a algunas enfermedades durante un largo período de tiempo (muchos meses)
  • Las contaminaciones cruzadas son poco probables, ya que se necesita una gran cantidad de contaminación para producir un resultado positivo (es concentración dependiente)
Figura 2. Valores o títulos de ELISA tras la inmunización.

Figura 2. Valores o títulos de ELISA tras la inmunización.

  • Es posible que, con un simple valor de ELISA, no se pueda identificar completamente la fase de la infección (se necesita la historia clínica, ver figura 2)
    • X = valor ELISA
    • Hay tres momentos distintos de un brote que pueden producir el mismo valor de ELISA, pero la interpretación y las acciones a tomar serían bastante diferentes:
      • Punto A – Principios de la infección – el brote está empezando; pueden tomarse acciones
      • Punto B – Finales de la infección – el brote se está acabando; ya no se puede hacer gran cosa
      • Punto C – Segundo brote – Está empezando un segundo brote. Se deben examinar las medidas de bioseguridad o las causas del rebrote
    • Es posible que se necesite una segunda muestra de los mismos animales al cabo de 10 días - 2 semanas para terminar de determinar la etapa en la que nos encontramos (junto con el historial clínico)
      • Si los resultados del segundo test son más altos, probablemente estemos en el punto A
      • Si los resultados del segundo test son mucho más altos, probablemente estemos en el punto C
      • Si los resultados del segundo test no cambian, probablemente estemos en una fase de meseta
      • Si los resultados del segundo test disminuyen, probablemente estemos en el punto B
  • Unos valores S:P elevados a menudo pueden estar asociados con una exposición más reciente
    • Especialmente tras una segunda exposición o una vacunación de refuerzo (ver figura 2) (sólo el ELISA de anticuerpos)
    • Es importante señalar que sólo porque una infección sea reciente no implica que el patógeno todavía esté presente (es decir, el animal sea virémico o bactéremico) (sólo el ELISA de anticuerpos)
      • Esto se cumple especialmente en el virus del Síndrome Reproductivo y Respiratorio Porcino (PRRS).
        • Los cerdos pueden ser ELISA negativos y, aun así, virémicos
        • Los cerdos pueden tener valores de anticuerpos elevados en el ELISA y no ser virémicos
        • Para establecer el nivel de viremia en los animales se usa la PCR
  • Valores S:P bajos
    • Es posible que una enfermedad en concreto no esté estimulando suficientes anticuerpos para su detección
      • Mycoplasma hyopneumoniae se adhiere principalmente a los cilios pulmonares y no estimula una producción elevada de IgG en suero
        • Una infección de campo reciente produce unos resultados ELISA más potentes
      • Las vacunas frente a Mycoplasma hyopneumoniae no estimulan una respuesta de IgG fuerte
        • Distintos test ELISA detectan las vacunas de modo diferente
        • Normalmente sólo alrededor del 30% de los animales vacunados seroconvierten
    • Los cerdos tratados con antibióticos durante varias semanas pueden suprimir el crecimiento bacteriano durante este período, disminuyendo la exposición a la enfermedad (pero no eliminándola), lo que conlleva una respuesta inmune a la exposición menor o más débil
      • Usar antibióticos frente a Mycoplasma hyopneumoniae a principios o mediados de la transición
      • Usar antibióticos frente a patógenos entéricos como Lawsonia intracellularis a principios o mediados de la transición.

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