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El test PCR como herramienta de diagnóstico (1/2): Principios básicos

Te explicamos cómo funciona la PCR y qué debemos tener en cuenta al interpretar los resultados.

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una de las herramientas de diagnóstico más comunes utilizadas hoy en día por los veterinarios de producción porcina. Se usa no solo con fines diagnósticos, sino también para mejorar la bioseguridad a través de la vigilancia y control de enfermedades. Como tal, es fundamental comprender las ventajas y desventajas de dicha tecnología al interpretar los resultados. También es importante recordar que, aunque se use la misma tecnología para diferentes patógenos, debe haber diferencias en la interpretación de estos resultados.

Información del test

La PCR está diseñada para la detección de material genético (ADN o ARN) de bacterias o virus. El proceso comienza con la extracción del ADN o ARN de la muestra, que posteriormente se somete a ciclos térmicos de amplificación. Si el material extraído es ARN, el primer paso será convertir el ARN en ADN (conocido técnicamente como ADN complementario o ADNc). Los ciclos térmicos consisten en un proceso de 3 pasos: 1) desnaturalización, 2) alineamiento y 3) extensión, en el que se obtiene como resultado la duplicación del ADN presente en la muestra. Por lo tanto, para cada ciclo (1 Ct), suponiendo una eficiencia del 100%, se obtendrá el doble de ADN presente. El objetivo es continuar con el proceso de amplificación hasta que se detecte suficiente ADN para que la muestra sea positiva o hasta 30-40 ciclos, según el diseño de la prueba específica utilizada.

Esquema del mecanismo de la PCR.

Esquema del mecanismo de la PCR.

El proceso de extracción es un paso crítico de la prueba PCR, ya que afecta a la cantidad y la calidad del material genético en la muestra analizada. Es fundamental utilizar el proceso de extracción adecuado para el tipo de muestra que se está analizando (suero, fluidos orales, tejido, etc.). El paso 2 del proceso de amplificación (alineamiento) requiere el uso de primers o cebadores, que son piezas cortas de secuencias de ADN diseñadas específicamente para unirse y ayudar a replicar la secuencia genética específica del patógeno en cuestión. Para los patógenos que evolucionan genéticamente de forma constante (como el virus del PRRS), estos cebadores deben actualizarse periódicamente para garantizar que se sigan detectando nuevas cepas.

El umbral de ciclos de la prueba (generalmente alrededor de 30-40) se establece al determinar que si el proceso de amplificación continuase, la prueba resultaría finalmente positiva debido al alineamiento y extensión espontáneos. Esto sugiere que los resultados positivos débiles, con valores de Ct altos cerca del umbral, necesitan una consideración especial al interpretar los resultados, especialmente al final de un brote.

Existen dos usos diferentes de pruebas PCR en medicina veterinaria porcina. La tradicional PCR en gel y la más moderna PCR en tiempo real. Ambas pruebas funcionan de la misma manera, basándose en la amplificación del ADN o ARN. La diferencia es que la PCR en gel se "lee" solo una vez al final de la prueba, mientras que en la PCR en tiempo real los resultados de la prueba se "leen" después de cada ciclo. La ventaja de la PCR en tiempo real es que permite obtener resultados cuantitativos/semicuantitativos.

Agrupación de muestras para el análisis

Las pruebas PCR tienen una gran capacidad para detectar pequeñas cantidades de material genético en las muestras (sensibilidad analítica) gracias al proceso de amplificación, lo que ofrece la posibilidad de analizar múltiples muestras con una sola prueba (pooling o agrupación). Es importante recordar que la agrupación, por definición, diluirá la muestra analizada. Esto no debería ser un problema cuando la concentración esperada de un patógeno determinado es alta (especialmente al inicio del brote de la enfermedad). Sin embargo, la agrupación puede ser un problema cuando la concentración del patógeno en una muestra positiva es baja, como al final de un brote de enfermedad o en un tipo de muestra que ya se espera diluida (fluidos orales).

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