使用 qPCR（定量聚合酶链反应）检测单独圈养和群养的猪的口腔液样本

使用 qPCR（定量聚合酶链反应）检测单独圈养和群养的猪的口腔液样本

J Maldonado^1, L Valls¹, A Camprodon¹, R Riquelme¹, P Riera¹

1Diagnos, HIPRA Amer, Girona, Spain, jaime.maldonado@hipra.com

简介

      萎缩性鼻炎（Atrophic rhinitis，AR）是由支气管败血波氏杆菌（Bordetella bronchiseptica，Bb）和D型多杀性巴氏杆菌（PMT（Toxigenic strains of Pasteurella multocida）的产毒株引起的。死前AR监测通常是在鼻部拭子(Nasal swab，NS)通过细菌培养、PCR（polymerase chain reaction [聚合酶链反应]）或抗原检测来直接检验的。3口腔液（Oral fluid，OF）定期检测使得便捷地采集猪群层面疾病数据成为可能，而且已经通过评估可用于检测猪群中各种细菌和病毒性疾病。4 据笔者所知，还没有发现商品化养猪场使用口腔液用于检测Bb和PMT的既往报告。因此，本研究旨在确定从单独饲养或群养的猪里采集的口腔液样本，是否可以被qPCR检测到含有Bb和PMT。

材料与方法

      最初作为Bb（flaA基因）和PMT（toxA基因）检测的常规PCR1,2 开发的两项试验改进为与SYBR Green I 检测和熔解曲线分析（qPCR）联用的实时模式。分别采用Bb和PMT参考菌株以及一组猪病毒及细菌呼吸道病原体对分析灵敏度和特异性进行了评估。猪栏样本来自10个生长育肥猪场的46栏（20-25头猪／栏，4-16周龄），每个猪栏一份OF混合样本和一份4-7个NS的混合样本（每个猪群4-6栏）。从两个配种-妊娠群组中采集相同数量的成年母猪包含32份OF和NS个体样本。结果分析时，至少有一份qPCR样本检测呈阳性的猪群被认为对 Bb或PMT呈阳性。

结果

PCR试验成功改进为qPCR模式，能够以具有灵敏度和特异性的方式检测Bb和PMT，而且对其他猪病原体无交叉反应，且检验范围为1-10 ufc/ul。10个生长育肥猪场中，七个对Bb呈阳性，一个对PMT呈阳性。两个配种-妊娠猪场对PMT呈阴性，一个对Bb呈阳性。各个靶标和样本类型的qPCR阳性结果总结见表1。所有案例中，NS和OF样本检测结果以不同比例呈阳性。（数据未显示）。只有一头母猪的OF和NS检测结果对Bb均呈阳性。没有发现鼻拭子对PMT均阳性的案例。

表1.从46个猪栏的猪和32头单独圈养的母猪中采集的支气管败血波氏杆菌和多杀性巴氏杆菌qPCR呈阳性的口腔液和鼻拭子

OF= 口腔液；NS=鼻部拭子；Bb=B。支气管败血波氏杆菌；PMT= 多杀性巴氏杆菌；1从20-25头猪的猪栏同时采样。从每个猪栏获取一份OF和4-7份鼻部拭子混合样本。

结论与讨论

      此项研究证明，猪OF可能含有可以被qPCR检测到的Bb和PMT的遗传物质。同个动物或同组动物的OF和NS的检测率是一致的。这些结果表明，OF可以用于猪的AR监测，在样品采集过程中减少工作量和动物压力，并在猪AR方面为育种和生长的猪的健康状况提供有价值的信息。

      研究发现表明，有客观比例的猪不受Bb感染，虽然这种传染性疾病猪的呼吸道内很常见。然而，值得注意的是，少数受试动物可能对得出的结果产生了影响。无论如何，这些研究结果将鼓励研究者使用本文所述的方法结合猪群生产数据作更深入的研究，寻找Bb和PMT的流行和发病率可能的关系。

致谢

Mireia Blanch, Sandra Alonso and Miriam Oria (Diagnos HIPRA, Girona, Spain.)

参考文献

1.Hozbor D et al. 1999.Res.Microbiol.150:333−41.

2.Kamp EM et al. 1996.J Vet Diagn Invest 8:304-09.

3.OIE Terrestrial Manual.2012.Chapter 2.8.2.

4.Prickett JR et al. 2010.Anim Health Res Rev 11:207-16.