Chẩn đoán phân tử PRRS: Khi giải trình tự 4% hệ gen là chưa đủ

Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) along with African swine fever virus is one of the most economically important pathogens affecting the swine industry globally. The recent emergence of aggressive PRRSV strains like the Highly Pathogenic PRRSV (HP-PRRSV) in Asia, Rosalia in Europe, and the L1C.5 in North America has ignited the discussion on the need to further improve PRRSV diagnostics and control.

Virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở heo (PRRSV), cùng với virus dịch tả heo châu Phi (ASFV), là một trong những tác nhân gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng nhất đối với ngành chăn nuôi heo trên toàn cầu. Sự xuất hiện gần đây của các chủng PRRSV có độc lực cao như HP-PRRSV tại châu Á, Rosalia tại châu Âu và L1C.5 tại Bắc Mỹ đã thúc đẩy các cuộc thảo luận về việc cần cải thiện các phương pháp chẩn đoán và kiểm soát PRRSV.

Hiện nay, kỹ thuật RT-PCR được sử dụng phổ biến trên toàn thế giới để phát hiện vật liệu di truyền của PRRSV trong các chương trình giám sát đàn heo.

Một bước tiến xa hơn so với việc chỉ phát hiện RNA virus là giải trình tự gen PRRSV, thường được thực hiện bằng phương pháp Sanger. Trên toàn cầu, vùng gen được sử dụng phổ biến nhất để giải trình tự PRRSV là ORF5, mặc dù một số phòng thí nghiệm cũng thực hiện giải trình tự ORF7.

Tuy nhiên, ORF5 chỉ chiếm khoảng 4% bộ gen của PRRSV và ORF7 chiếm khoảng 2,4%, do đó không cung cấp đầy đủ thông tin di truyền của toàn bộ hệ gen virus.

Trong những năm gần đây, việc ứng dụng công nghệ giải trình tự thế hệ mới (NGS) để giải trình tự toàn bộ hệ gen PRRSV ngày càng được quan tâm, đặc biệt trong các nghiên cứu dịch tễ học PRRSV ở cấp độ đàn hoặc hệ thống sản xuất (Hình 1).

Trong quá trình nhân lên, PRRSV liên tục xảy ra các biến đổi và đột biến di truyền, từ đó có thể dẫn đến sự xuất hiện của các biến thể virus mới. PRRSV được xem là một trong những virus có tốc độ đột biến cao, khoảng 0,5–1% mỗi năm. Tốc độ này không phân bố đồng đều giữa các vùng khác nhau của hệ gen, giữa các loại virus và các dòng (lineage) di truyền, khiến virus liên tục tiến hóa về mặt di truyền. Đáng chú ý, các đột biến và quá trình tiến hóa của virus có thể xảy ra trên toàn bộ hệ gen. Vì vậy, việc chỉ giải trình tự một phần hệ gen, chẳng hạn ORF5 hoặc ORF7, có thể bỏ sót những biến đổi di truyền xảy ra ở các vùng không được giải trình tự (Hình 1).

Trong bối cảnh này, NGS ngày càng trở thành công cụ có giá trị trong điều tra dịch tễ học nhờ khả năng cung cấp dữ liệu trên gần như toàn bộ hệ gen PRRSV.

NGS có thể được ứng dụng hiệu quả như thế nào trong thực tế sản xuất?

Để tối ưu hiệu quả ứng dụng công nghệ NGS, cần lưu ý một số điểm sau:

• Việc phối hợp sớm giữa bác sĩ thú y và chuyên gia chẩn đoán phòng thí nghiệm là rất quan trọng nhằm thống nhất câu hỏi chẩn đoán, mục tiêu cần đạt được và phương pháp xét nghiệm phù hợp.
• Trang trại hoặc hệ thống sản xuất đã có sẵn trình tự hệ gen hoàn chỉnh của một chủng PRRSV tham chiếu hay chưa?
  • Nếu chưa, nên sử dụng NGS trên các mẫu dương tính với PRRSV bằng RT-PCR có giá trị Ct thấp, lý tưởng là < 24, để giải trình tự toàn bộ hệ gen và thiết lập chủng tham chiếu cho đàn. Giá trị Ct có mối liên quan nghịch với lượng vật liệu di truyền của virus trong mẫu, tức là: Ct càng thấp, tải lượng virus càng cao và khả năng giải trình tự thành công bằng NGS càng lớn.
  • Việc có một chủng tham chiếu sẽ giúp so sánh với các hệ gen virus được giải trình tự sau này, từ đó theo dõi quá trình tiến hóa di truyền của PRRSV trong trang trại, luồng sản xuất hoặc toàn hệ thống.
• Mục tiêu của việc thực hiện NGS là gì?
  • Nếu mục tiêu là phát hiện sự tiến hóa của virus ở cấp độ toàn hệ gen: nên ưu tiên sử dụng mẫu phổi và huyết thanh vì đây là các loại mẫu có khả năng giải trình tự được toàn bộ hệ gen cao hơn.
  • Nếu mục tiêu là đánh giá mức độ đa dạng virus trong trang trại hoặc đàn: nên sử dụng các loại mẫu đại diện quần thể như dịch thiến, dịch miệng hoặc mẫu gộp từ nhiều cá thể (ví dụ huyết thanh gộp), vì các loại mẫu này có khả năng phát hiện đồng thời nhiều chủng virus nếu chúng hiện diện trong mẫu.
• Đồng nhiễm từ hai chủng PRRSV trở lên trong cùng một đàn là tình trạng hoàn toàn có thể xảy ra (Hình 2a). Nếu các chủng virus này có mức độ tương đồng di truyền cao, NGS có thể không giải trình tự hoàn chỉnh được toàn bộ hệ gen của từng chủng.
  • Khi trong mẫu có nhiều chủng virus cùng hiện diện, NGS có thể tạo ra các đoạn trình tự liên tục, gọi là “contig”, từ nhiều virus khác nhau. Việc so sánh các contig này với chủng tham chiếu của trang trại có thể giúp xác định liệu mẫu có chứa nhiều chủng virus khác nhau hay không (Hình 2b)
• Cuối cùng, cần có đội ngũ hỗ trợ phân tích và đối chiếu dữ liệu di truyền, đồng thời chủ động phối hợp về thời gian trả kết quả, bởi NGS thường là một quy trình mất nhiều thời gian và có thể kéo dài hơn một tuần mới hoàn tất.

NGS có thể cung cấp những thông tin dịch tễ học nào

Dữ liệu thu được từ NGS có thể giúp giải đáp nhiều câu hỏi quan trọng:

1. Virus có tiến hóa thông qua các đột biến thay thế nucleotide ngẫu nhiên tại cùng một vị trí trên hệ gen hay không? Virus đã thay đổi bao nhiêu giữa hai thời điểm lấy mẫu và những thay đổi đó xảy ra ở vùng gen nào (ORF nào)?
2. Virus có tiến hóa thông qua chèn thêm hoặc mất đoạn trên hệ gen hay không?
3. Có xảy ra sự xâm nhập của một chủng virus mới, không liên quan về mặt di truyền, vào trang trại, đàn hoặc luồng sản xuất hay không?
4. Dù ít gặp hơn nhưng vẫn có khả năng xảy ra: liệu virus mới có xuất hiện các biến đổi tại vùng hệ gen đích của RT-PCR hoặc vùng gắn mồi/probe trong giải trình tự Sanger, khiến các xét nghiệm này không còn phát hiện được virus hay không?
5. Virus có xảy ra hiện tượng tái tổ hợp (recombination), trong đó một số đoạn hệ gen được hình thành từ hai hoặc nhiều chủng virus khác nhau, hay không?

Tái tổ hợp là quá trình tiến hóa tự nhiên của PRRSV, trong đó hai chủng virus cùng nhân lên trong một tế bào và tạo thành một chủng virus mới. Hiện tượng tái tổ hợp sẽ được phân tích sâu hơn trong bài viết “Những thách thức từ hiện tượng tái tổ hợp PRRSV” (The implications of the PRRSV recombination dilemma).