Diagnostic moléculaire du SDRP : quand séquencer seulement 4 % ne suffit pas

Le virus du syndrome dysgénésique et respiratoire porcin (SDRPv) est, avec le virus de la peste porcine africaine, l'un des agents pathogènes ayant le plus grand impact économique sur l'industrie porcine mondiale. L'apparition récente de souches très agressives du SDRPv, telles que le SDRP hautement pathogène (HP-SDRPv) en Asie, Rosalia en Europe et L1C.5 en Amérique du Nord, a relancé le débat sur la nécessité de continuer à améliorer le diagnostic et le contrôle du SDRPv.

L'utilisation de la RT-PCR pour détecter le matériel génétique du SDRPv est couramment utilisée dans le monde entier pour analyser les populations en recherche du virus.

Une étape supplémentaire par rapport à la détection de l'ARN est le séquençage génétique du SDRPv, qui est généralement réalisé à l'aide de la technique de Sanger. Au niveau mondial, la partie du virus la plus couramment utilisée pour le séquençage du SDRPv est l'ORF5, bien que certains laboratoires génèrent des rapports avec le séquençage de l'ORF7.

L'ORF5 représente environ 4 % et l'ORF7 environ 2,4 % du génome du SDRPv, ce qui ne permet pas d'obtenir une couverture génétique complète de l'ensemble du génome.

Ces dernières années, l'utilisation du séquençage de nouvelle génération (NGS, Next Generation Secuencing) pour la récupération de génomes complets du SDRPv à des fins de recherche épidémiologique au sein d'un élevage ou d'un système de production a suscité un intérêt croissant (figure 1).

Au cours du processus de réplication, le SDRPv subit des changements génétiques et des mutations qui peuvent potentiellement conduire à l'apparition de nouvelles variantes du virus. Le SDRPv est connu pour avoir un taux de mutation élevé, environ 0,5 à 1 % par an, réparti de manière inégale dans différentes régions du génome, différents types de virus et lignées génétiques, ce qui conduit à une évolution génétique constante. En particulier, la mutation et l'évolution génétique du virus peuvent se produire dans tous les gènes, de sorte que le séquençage d'une seule partie du génome, par exemple ORF5 ou ORF7, est susceptible de ne pas détecter les changements survenus en dehors de la région séquencée (figure 1).

Dans ce contexte, le séquençage NGS devient un outil utile en offrant la possibilité de récupérer un génome complet du SDRPv à des fins de recherche épidémiologique.

Comment les vétérinaires et les producteurs peuvent-ils tirer parti de la NGS ?

Pour optimiser l'utilité du séquençage NGS, certains points doivent être pris en considération :

• Il est important que le vétérinaire et le laboratoire de diagnostic soient impliqués dès le début afin de s'aligner sur le diagnostic différentiel, les attentes et l'approche des tests.
• Disposons-nous d'une séquence complète du génome d'une souche de référence du virus SDRP provenant de l'élevage ou du système de production à des fins de comparaison ?
  • Si ce n'est pas le cas, utiliser le NGS sur des échantillons positifs par RT-PCR pour le SDRPv avec des valeurs Ct faibles, c'est-à-dire idéalement <24, afin de récupérer un génome complet comme souche de référence de l'élevage. La valeur Ct est inversement proportionnelle à la quantité de copies génétiques du virus présentes dans l'échantillon ; c'est-à-dire que plus la valeur Ct est faible, plus la charge virale attendue et le succès du NGS sont élevés.
  • Une souche de référence permet la comparaison ultérieure des génomes récupérés de manière prospective afin de comprendre l'évolution génétique du SDRPv au sein de l'élevage, du flux et du système.
• Quel est l'objectif d'un séquençage NGS ?
  • Si l'objectif est de détecter l'évolution du virus au niveau du génome complet : des échantillons de poumon et de sérum doivent être prélevés, car ces échantillons sont plus susceptibles de récupérer un génome complet.
  • Si l'objectif est de comprendre la diversité des virus dans un élevage, il convient d'utiliser des types d'échantillons populationnels tels que des fluides de transformation, des fluides oraux ou des échantillons individuels regroupés (pools). Par exemple, les échantillons de sérum regroupés sont plus susceptibles de récupérer plusieurs virus s'ils sont présents dans l'échantillon.
• Les infections mixtes par deux ou plusieurs virus SDRP dans un élevage sont une réalité (figure 2a), et si les deux virus sont très similaires, le NGS peut ne pas récupérer un génome complet ;
  • Si plusieurs virus sont présents dans l'échantillon, le NGS peut récupérer des fragments du génome, appelés « contigs », provenant de différents virus, qui, lorsqu'ils sont comparés à une souche de référence de l'élevage, peuvent aider à déterminer si plusieurs virus sont présents dans l'échantillon (figure 2b) ;
• Enfin, assurez-vous de disposer d'une personne qui puisse vous aider dans l'analyse génétique et les comparaisons, et coordonnez les délais de réponse, car le NGS est généralement un processus lent qui peut prendre plus d'une semaine.
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Quel type d'informations épidémiologiques peut-on obtenir grâce au séquençage NGS ?

Les résultats générés par le NGS peuvent aider à répondre à des questions telles que :

1. Le virus a-t-il évolué par substitutions aléatoires de nucléotides aux mêmes positions génomiques ? Dans quelle mesure le virus a-t-il changé entre deux moments donnés et dans quelles régions du génome, c'est-à-dire les régions ORF, ces changements se sont-ils produits ?
2. Le virus a-t-il évolué par insertions ou délétions dans son génome ?
3. Y a-t-il eu une nouvelle introduction d'un virus non apparenté dans l'élevage ou le cycle de production ?
4. Bien que cela soit moins probable mais possible, le nouveau virus a-t-il acquis des modifications dans les régions génomiques ciblées par la RT-PCR ou le séquençage avec des amorces/sondes Sanger, rendant les tests incapables de détecter le virus ?
5. Le virus a-t-il subi une recombinaison, c'est-à-dire a-t-il acquis certaines régions génomiques de deux ou plusieurs virus parentaux ?

La recombinaison est un processus naturel d'évolution du SDRPv qui se produit lorsque deux SDRPv se répliquent dans la même cellule, générant un troisième virus dérivé. La recombinaison sera explorée plus en détail dans un prochain article que nous publierons prochainement sur 3trois3.com, intitulé « Les implications du défi de la recombinaison du SDRPv ».