Le test PCR comme outil de diagnostic (2/2) : utilisation et interprétation des résultats

Quelques utilisations du test PCR :

• Détecter la présence de l'ADN/ARN d'un pathogène donné - utilisation la plus courante.
• Sérotypage d'un agent pathogène pour des gènes spécifiques (ADN/ARN) dont on sait qu'ils varient d'un sérotype à l'autre (par exemple, les gènes de biosynthèse de la capsule pour Actinobacillus pleuropneumoniae).
• Détecter la présence de gènes de virulence (par exemple, le génotypage d'E. coli).

Il est important de se rappeler que les PCR ne font que détecter la présence de matériel génétique spécifique en fonction des amorces et n'indiquent pas si l'organisme peut être infectieux ou non. Lorsque les gènes sont analysés, le test détecte uniquement la présence du gène mais ne confirme pas si l'organisme exprime le facteur de virulence détecté.

Ces dernières années, les laboratoires ont mis au point des PCR multiplexes pour analyser simultanément plusieurs agents pathogènes ou plusieurs souches ou gènes d'un même agent pathogène. Ces PCR multiplexes sont des PCR multiples exécutées en même temps. Leur coût est plus élevé qu'une seule PCR mais beaucoup plus faible que la réalisation de plusieurs PCR séparément, car les laboratoires réalisent des économies considérables en termes d'équipement, de personnel de laboratoire et de réactifs. Le laboratoire utilisera différents marqueurs pour identifier quels résultats positifs correspondent à quelle amorce. Souvent, ces PCR multiplexes sont très utiles, comme dans le génotypage d'E. coli où environ 14 gènes peuvent être analysés en même temps dans le même isolat bactérien. D'autres exemples sont l'analyse simultanée pour le SDRP type 1 et type 2 ou pour la diarrhée épidémique porcine et le delta coronavirus porcin. Il est essentiel de garder à l'esprit que le développement de ces tests n'est pas toujours facile, car le laboratoire doit s'assurer qu'il n'y a pas d'interférence entre les différentes PCR. Cela signifie que les températures de cyclage et les différentes amorces utilisées ne s'inhibent pas et ne présentent pas de réaction croisée entre elles. Chacune de ces PCR multiplexes doit être validée avant d'être utilisée et entraîne une optimisation importante du test.

Considérations sur l'interprétation des résultats :

L'un des plus grands défis de la PCR est que chaque laboratoire a souvent un protocole différent pour l'analyse des échantillons, ce qui peut signifier des différences dans le processus d'extraction de l'ADN/ARN, les protocoles de cycle, ainsi que les amorces utilisées. Cela peut rendre difficile la comparaison des résultats obtenus dans différents laboratoires.

Résultat négatif

• Échantillon/élevage vraiment négatif pour l'agent pathogène
  • Veiller à envoyer des échantillons appropriés pour l'agent pathogène en question. Quelques exemples typiques à considérer :
  • Le virus de la grippe ne devient pas systémique, il ne sera donc pas retrouvé dans les échantillons de sang.
  • La recherche de Mycoplasma hyopneumoniae dans les échantillons de fluides oraux donne rarement un résultat positif car l'agent pathogène se lie normalement aux cils du système respiratoire inférieur.
  • La soumission d'un seul fœtus avorté pour le SDRP ne donne que 50% de chances d'être positif. Au moins 4 fœtus doivent être soumis pour maximiser les chances de trouver un échantillon positif.
• Échantillon prélevé trop tard dans le développement de la maladie, de sorte que l'agent pathogène n'est plus présent.
  • Le virus de la grippe est présent dans les sécrétions nasales uniquement pendant les 3-4 premiers jours.
• Incompatibilité des amorces
  • Nouvelle souche du SDRP
• Faible prévalence dans l'élevage et chez les animaux non infectés échantillonnés
  • Nécessité d'augmenter significativement le nombre d'animaux échantillonnés
• Dilution d'un échantillon faiblement positif en raison du regroupement des échantillons
  • Pooling (regroupement) de fluides oraux qui sont généralement des échantillons déjà dilués (test de plusieurs porcs et valeurs Ct élevées déjà attendues dans les échantillons positifs).

Résultat positif

• Échantillon/élevage réellement positif pour l'agent pathogène
• Ne permet pas de distinguer si l'échantillon est infectieux ou non infectieux.
• Selon l'agent pathogène, la détection de l'ADN/ARN ne confirme pas toujours la maladie.
  • Un tissu pulmonaire positif par PCR pour Mycoplasma hyopneumoniae confirme la présence de l'organisme dans le tissu mais pas la gravité ou l'importance clinique de l'agent pathogène. Dans la plupart des élevages (à l'exception des élevages négatifs pour Mycoplasma), une confirmation visuelle du pourcentage de lésions pulmonaires (évaluation macroscopique) est nécessaire pour déterminer la signification clinique des résultats.
  • Une PCR sérique positive pour le circovirus porcin de type 2 (PCV2) confirme la présence du PCV2 mais ne permet pas de savoir si l'amaigrissement ou la pneumonie est attribuable au PCV2 ou s'il y a eu échec de la vaccination. Une immunohistopathologie du poumon et/ou du tissu lymphoïde est nécessaire pour démontrer la maladie associée au PCV2.
• Le test ne permet pas de distinguer le virus/bactérie du vaccin vivant modifié de l'infection sur le terrain.
  • Il est important de connaître le moment et le type de vaccin utilisé.
  • Des informations de séquençage peuvent être nécessaires.
• Contamination croisée si les échantillons ne sont pas manipulés correctement.
  • Surtout lorsqu'il s'agit de regrouper des échantillons. Le pooling doit être effectuée sous une hotte de laboratoire.
  • Les échantillons de matières fécales prélevés dans le sol peuvent être contaminés par des traces environnementales de l'agent pathogène.
• Des valeurs Ct basses sont associées à une concentration élevée de virus/bactéries dans l'échantillon et peuvent souvent être corrélées à une probabilité accrue de maladie clinique.
  • Les faibles valeurs de Ct de Lawsonia intracellularis dans les fèces sont peut-être plus étroitement liées à des lésions intestinales
    • Ct < 20 → Entéropathie proliférante porcine
    • Ct > 30 → Aucune lésion intestinale détectée

Génotypage

• L'utilisation du génotypage par PCR est devenue plus courante, notamment pour E. coli. Il fournit des informations épidémiologiques sur les changements de souches affectant l'élevage (par exemple, grippe H1N1 vs H3N2).
• Les résultats du génotypage sont souvent utilisés pour sélectionner le vaccin à utiliser, comme pour E. coli (confirmation des pili).
• Il est important de se rappeler que les résultats ne représentent qu'une seule souche et que les porcs sont souvent infectés par plusieurs souches en même temps.
• La détection ne confirme que la présence des gènes de virulence mais pas leur expression. Il suffit souvent de savoir qu'il a le potentiel génétique pour exprimer le gène.
• Comme le coût et la facilité du séquençage des gènes continuent de diminuer, l'utilisation ou la nécessité du génotypage par PCR diminuera.