Секвенирование и интерпретация его результатов при использовании в программах борьбы с РРСС

Вступление

Геном вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней (РРССВ) представлен одноцепочечной молекулой РНК, что объясняет его крайнюю подверженность генетическим мутациям. Это также делает каждый штамм вируса РРСС уникальным - настолько, что генотипирование является весьма полезным методом диагностики и борьбы с заболеванием. Диагностическое генотипирование проводится путем определения последовательности нуклеотидов на отрезке ДНК, копирующем геномный фрагмент вирусной РНК (секвенирование ДНК). Наиболее часто для этого в настоящее время используется фрагмент ORF5 – ген, кодирующий основной оболочечный гликопротеин. В значительной мере это обусловлено тем, что он обладает неограниченным генетическим разнообразием.

 

Диагностическое секвенирование ДНК

Разница между вирусами РРСС первого (европейский) и второго (американский) типа легко выявляется с помощью большинства диагностических ПЦР-тест-систем. В то же время, установление различий между отдельными штаммами каждого из этих двух генотипов требует проведения секвенирования ДНК. С этой целью биологические жидкости или ткани, содержащие вирус РРСС в умеренных или высоких концентрациях, обрабатываются таким образом, чтобы изолировать РНК, которая затем копируется на ДНК методом обратной транскрипции, после чего ген ORF5 амплифицируется с помощью ПЦР и попадает на оборудование для проведения секвенирования ДНК. Этот процесс почти полностью автоматизирован и обычно занимает от одного до трех дней. Полученные в результате необработанные данные поступают в диагностическую лабораторию для анализа. Стандартный отчет о результатах содержит описание нуклеотидных последовательностей исследованного штамма, его сходство со стандартными штаммами, используемыми в вакцинах. Некоторые лаборатории, помимо этого, предоставляют результаты сравнения со стандартными панелями изолятов вируса РРСС дикого типа, представленные в виде дендрограмм. Также, могут предоставляться данные о результатах сравнения с последовательностями РРССВ, описания которых содержатся в производственной базе данных.

 

Анализ последовательностей РРССВ

Схожесть или идентичность последовательностей выявляется путем сопоставления двух или более последовательностей с помощью компьютерной программы. Пример сопоставления нескольких последовательностей ORF5 с пяти различных ферм приведен на Рис.1. Попарные сравнения процентной степени их идентичности, лежащие в пределах от 81,2% до 99,8%, представлены в таблице. Дендрограмма результатов полигенетического анализа демонстрирует группировку схожих последовательностей (Рис.2). Ключевой вопрос, встающий перед производителями и ветеринарами, это – являются ли выявленные генетические различия в последовательностях обычными вариациями одного и того же штамма вируса РРСС или они свидетельствуют о присутствии на ферме различных штаммов?

Рис.1. Фрагмент сопоставления последовательностей ORF5 штаммов вируса РРСС пяти разных ферм. С ферм 1, 4 и 5 было получено по нескольку последовательностей. Точки в последовательностях соответствуют позициям, идентичным референтному штамму Lelystad вируса РРСС первого типа.

 

Рис.2. Дендрограмма последовательностей ORF5, полученных для пяти разных ферм. Пример расшифровки: на Ферме 1 присутствуют 2 несвязанных штамма. Степень идентичности трех последовательностей друг другу >99%, в то время, как четвертая соответствует им только на ~83%. Зато она соответствует вирусу Lelystad. Два штамма с Фермы 4 тесно связаны друг с другом (идентичны на 99,5%). На Ферме 5 присутствуют два несвязанных штамма. Степень соответствия трех штаммов друг другу >98%, а четвертому – только около 81%.

Таблица. Попарное представление идентичности всех сопоставленных последовательностей ORF5 серий образцов вируса РРСС первого типа в процентах.

1-4	1-6	1-9	1-25	2-10	3-1	4-4	4-3	5-351	5-358	5-470	5-473	Lelystad
***	83.5	83.3	83.7	93.2	92.6	86.1	86.0	88.1	88.0	83.2	88.3	98.7	1-4
	***	99.2	99.7	84.2	83.0	86.0	86.0	81.4	81.2	86.3	81.4	82.1	1-6
		***	99.5	84.5	83.3	85.6	85.6	81.4	81.2	86.5	81.4	81.9	1-9
			***	84.5	83.3	86.0	86.0	81.7	81.5	86.8	81.7	82.2	1-25
				***	98.2	86.6	86.5	91.1	90.9	84.2	90.4	93.3	2-10
					***	84.4	84.2	90.2	90.0	83.3	89.7	92.9	3-1
						***	99.5	82.5	82.7	90.6	82.5	84.8	4-4
							***	82.3	82.5	90.9	82.2	84.6	4-3
								***	99.8	81.0	98.3	88.4	5-351
									***	81.2	98.2	88.2	5-358
										***	80.9	83.2	5-470
											***	88.8	5-473
												***	Lelystad

 

Интерпретация последовательностей РРССВ

Последовательность ORF5 содержит около 600 нуклеотидов. Общая мутируемость этого гена, по разным оценкам, составляет от 0,5% до 1% в год. Отличия в скорости генетических изменений определяются различными факторами невирусной природы. На репликацию и трансмиссивность вируса РРСС у свиней большое внимание оказывает уровень их специфического и неспецифического иммунитета, создающий сильное ингибирующее давление, приводящее к уменьшению числа вирусных копий. Уменьшение вирусной нагрузки приводит к снижению трансмиссивности, снижая тем самым общую репликацию вируса и степень его изменчивости. Таким образом, иногда может наблюдаться более высокая или более низкая генетическая изменчивость, выходящая за предполагаемые рамки 0,5%-1% в год.

Главным вопросом при проведении генетического анализа является вопрос о том, являются ли две последовательности близкородственными (двумя вариантами одного и того же штамма) или независимыми (принадлежащим двум несвязанным штаммам). Общепринято, что вывод о том, связаны ли изоляты вируса РРСС или нет, делается, исходя из степени схожести, попадающей в интервал достоверности 97% или 98%. Очевидно, что безоговорочное, сделанное без учета всех сопутствующих факторов, принятие за основу предпосылки о двух- или трехпроцентной генетической разнице между двумя изолятами может привести к неверным выводам. Различия между двумя вариантами одного и того же штамма, циркулирующего в поголовье на протяжении нескольких лет, постепенно выбьются за пределы данного интервала. Степень достоверности выводов о близкородственности может быть повышена получением доступа к дополнительной информации, включая даты и локализацию получения изолятов. Очень важен анализ, противопоставляющий новые последовательности РРССВ широкому референтному набору, являющемуся показательным для фермы, региона, используемой технологии или даже генетического разнообразия в глобальном масштабе.

Секвенирование ДНК штаммов вируса РРСС может вскрыть их родственность или независимость (Рис.2), но не может быть использовано для прогноза или объяснения степени иммунологической защиты или вспышек в иммунных поголовьях. Также, секвенирование ДНК не позволяет судить о клинических последствиях инфицирования данным конкретным штаммом, в силу того, что идентификация генетических маркеров вирулентности отсутствует.

В настоящее время, в основном в США, но также и в Европе осуществляется множество региональных проектов по борьбе с РРСС. Полное представление о том, с какими разновидностями вируса приходится иметь дело при начале мероприятий по обузданию инфекции и борьбе с ней является критичным как для эффективного их мониторинга, так и для идентификации новых, интродуцированных на фермах или в регионе, штаммов.