ELISA как диагностический инструмент (2/2): интерпретация результатов

Информация по интерпретации результатов:

• Свиньям, подвергшимся воздействию патогена (дикого типа или вакцины), требуется время для выработки достаточного количества антител для обнаружения с помощью ELISA (обычно не менее 2-4 недель после контакта, в зависимости от патогена и целевого антитела).
• Анализы ELISA на антитела не могут дифференцировать материнские антитела (пассивные антитела) от антител, вызванных воздействием (активные антитела).
• Анализы ELISA на антитела часто не могут отличить антитела, вызванные вакциной, от антител, вызванных воздействием дикого типа.
• В некоторых случаях могут быть разработаны специальные анализы ELISA для дифференциации инфицированных и вакцинированных животных (вакцины DIVA).
• Результаты ELISA на антитела не предполагают защиты. Защита может исходить от различных антител, которые не могут быть измерены с помощью анализа, или с помощью клеточно-опосредованного иммунитета, который полностью отличается от гуморального иммунитета или иммунитета, опосредованного антителами, и не измеряется с помощью анализа ELISA.
• ELISA на антиген значительно менее чувствителен (низкая аналитическая чувствительность) при обнаружении антигена по сравнению с ПЦР. Анализ ПЦР активно реплицирует присутствующую ДНК/РНК и, следовательно, может обнаруживать чрезвычайно низкие уровни вирусов или бактерий. С другой стороны, антигенный ELISA требует значительно большей концентрации вируса или бактерий, чтобы иметь возможность вызвать достаточное изменение цвета, чтобы его можно было обнаружить.
• Результаты стандартизированы и обычно непротиворечивы в разных лабораториях при использовании серийно выпускаемых наборов ELISA (широкодоступных и широко используемых). Собственные лабораторные анализы ELISA могут давать большие различия в результатах, если производственная практика не является строго стандартизированной и несоблюдённой.
• Не все патогены вызывают измеримый иммунный ответ
• Каждый набор ELISA обычно тестирует разные белки, которые могут давать совершенно разные результаты для одного и того же образца. Ярким примером этого является множество различий в доступных наборах ELISA на антитела к Mycoplasma hyopnemoniae; определенно не все комплекты созданы одинаково.
• Доза и/или путь воздействия могут влиять на уровень иммунного ответа (уровень выработки антител).
• Важно знать сообщаемую чувствительность анализа (способность обнаруживать истинно положительные результаты) и специфичность (способность определять истинно отрицательные результаты как отрицательные; отсутствие перекрестных реакций).
• Могут возникать ложноположительные и ложноотрицательные результаты, поскольку степень воздействия и иммунный ответ на патогены различаются между отдельными свиньями (нормальное распределение) и часто существует некоторая фоновая или перекрестная реактивность, которую невозможно полностью устранить (см. Рисунок 1).
• Антитела обычно сохраняются/измеряются в течение нескольких месяцев после заражения/вакцинации.

Отрицательный результат

• Образец/поголовье действительно отрицательные в отношении возбудителя (отсутствие воздействия и отсутствие вакцины).
• Образец поголовья действительно отрицательный на возбудитель, хотя животные могут быть вакцинированы (если анализ имеет возможности DIVA) (ELISA только на антитела)
• В образце недостаточно антигена для обнаружения (только антиген ELISA)
• Образец, взят слишком рано при заболевании, свинье не удалось развить определяемый иммунный ответ (ELISA только на антитела)
  • При РРСС часто требуется 7-10 дней для сероконверсии.
  • Вирус гриппа присутствует в выделениях из носа только в течение первых 3-4 дней.
• Образец взят слишком поздно при заболевании, и возбудитель больше не присутствует.
  • Вирус гриппа присутствует в выделениях из носа только в течение первых 3-4 дней.
• Несоответствие целевого антитела/антигена
  • Различные штаммы гриппа (различия между H1N1 и H3N3, а также различия между различными классами H1N1)
• Низкая распространенность в поголовье, и отобранные животные не были инфицированы.
  • Необходимо увеличить количество отобранных животных
• Конкретное заболевание может не стимулировать достаточное количество антител для его обнаружения
  • Mycoplasma hyopneumoniae в основном прикрепляется к ресничкам в легких и не стимулирует высокую продукцию IgG в сыворотке.
    • Недавнее полевое заражение дает гораздо более сильные результаты ELISA
  • Вакцины против Mycoplasma hyopneumoniae не стимулируют сильный иммунный ответ IgG.
    • Различные анализы ELISA по-разному определяют вакцины
    • Обычно только около 30% вакцинированных животных становятся сероконверсивными
• Разбавление слабоположительного образца из-за объединения
  • • Категорически не рекомендуется объединять образцы!

Положительный образец

• Образец/поголовье действительно положительны на воздействие патогенов
• Невозможно отличить инфекционный или неинфекционный образец
• Невозможно отличить материнские антитела от естественного воздействия или вакцинации.
  • Большинство материнских антител исчезают к 8-12-недельному возрасту.
  • По мере взросления свиней значения ELISA должны со временем значительно снижаться.
  • Можно тестировать свиней с течением времени, чтобы подтвердить распад материнских антител, а также отсутствие воздействия в полевых условиях (отсутствие новых инфекций).
• В зависимости от целевого патогена обнаружение белка (антигена/антитела) не всегда подтверждает заболевание.
  • Сыворотка, которая дает положительный результат ELISA на антитела к цирковирусу свиней типа 2 (ЦВС-2), подтверждает воздействие ЦВС-2 как на вакцинированных, так и на инфицированных животных (оба случая довольно распространены), но не подтверждает, связаны ли истощение или заболевание с ЦВС-2 или неэффективностью вакцины. Необходимо провести иммуногистопатологию легочной и/или лимфатической ткани, чтобы продемонстрировать заболевание, связанное с ЦВС-2.
  • Анализ может быть не в состоянии отличить воздействие вакцинного вируса/бактерий от модифицированной живой вакцины от инфекции дикого типа (только ИФА антител).
    • Применяется как к убитым, так и к модифицированным живым вакцинам
    • Полезно знать время вакцинации, хотя и не критично, так как животные могут оставаться положительными на некоторые заболевания в течение длительного периода времени (много месяцев).
• Перекрестное загрязнение маловероятно, так как для получения положительного результата требуется большое количество загрязнения (зависит от концентрации).

• Одно значение ELISA может не полностью идентифицировать стадию инфекции (необходим анамнез)
  • См. рис. 2
  • X = значение ELISA
  • Три разных момента вспышки могут дать одно и то же значение ELISA однако интерпретация и необходимые действия будут совершенно разными:
  • • Точка А – начало инфекции – начинается вспышка; необходима реакция
    • Точка B – Поздняя стадия заражения – вспышка заканчивается; не так много, что можно сделать в этот момент
    • Точка C – Вторая вспышка – начинается вторая вспышка, необходимо принять меры по обеспечению биобезопасности/выявить причину повторной вспышки
  • Повторный сбор образцов от тех же животных через 10 дней–2 недели может потребоваться для дальнейшего определения стадии вспышки (наряду с клиническим анамнезом)
    • Если результаты второго образца выше, то, вероятно, вы в точке А
    • Если результаты второго образца значительно выше, то, вероятно, вы в точке C
    • Если результаты второго образца не меняются, вероятно, вы в фазе плато
    • Если результаты второй выборки ухудшатся, то, скорее всего, вы в точке B
• Высокие значения S:P часто могут быть связаны с недавним контактом
  • Особенно после повторного контакта или ревакцинации (см. рис. 2) (ELISA только на антитела)
  • Важно отметить, что тот факт, что инфекция произошла недавно, не означает, что возбудитель все еще присутствует (т. е. животное является виремическим или бактериемическим) (ELISA только на антитела)
    • Это особенно верно в отношении вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней (РРСС).
      • Свиньи могут быть отрицательными по ELISA, но при этом быть виремическими.
      • Свиньи могут иметь высокие значения антител ELISA и не быть виремическими
      • ПЦР-анализ используется для установления виремического статуса животных
• Низкие значения S:P
  • Конкретное заболевание может не стимулировать достаточное количество антител для обнаружения
    • Mycoplasma hyopneumoniae в основном прикрепляется к ресничкам в легких и не стимулирует высокую продукцию IgG в сыворотке крови.
      • Недавнее полевое заражение дает гораздо более сильные результаты ELISA
    • Вакцины против Mycoplasma hyopneumoniae не стимулируют сильный иммунный ответ IgG
      • Различные анализы ELISA по-разному определяют вакцины
      • Обычно только около 30% вакцинированных животных становятся сероконверсивными
  • Свиньи, которых лечат антибиотиками в течение нескольких недель, могут подавлять рост бактерий в течение этого времени, тем самым уменьшая воздействие болезни (но не устраняя ее), что приводит к более медленному или слабому иммунному ответу на воздействие.
    • Использование антибиотиков против Mycoplasma hyopneumoniae на ранних и средних стадиях доращивания
    • Использование антибиотиков против кишечных патогенов, таких как Lawsonia intracellularis, на ранних и средних стадиях доращивания.