ELISA как диагностический инструмент (1/2): Основы и применение

Введение

Использование иммуноферментного анализа (ELISA) для обнаружения белков (антигенов или антител) является одним из наиболее доступных диагностических инструментов во всем мире и широко используется сегодня в свиноводстве. Этот тест обычно используется для наблюдения и мониторинга заболеваний, а также в качестве диагностического инструмента. Поскольку ветеринары-свиноводы часто используют этот инструмент, очень важно понимать, как работает анализ, что он обнаруживает, а также его преимущества и недостатки при интерпретации результатов. Также важно помнить, что хотя одна и та же технология используется для разных патогенов, должны быть различия в интерпретации этих результатов.

Информация об исследовании

Анализы ELISA предназначены для обнаружения антигенов или антител против бактерий или вирусов. Антигены — это чужеродные белки, которые стимулируют выработку антител (антиген = генератор антител). Думая об антителах, всегда думайте, что они против белков. При разработке анализа производитель или лаборатория решают, на какой конкретный белок или белки они хотят ориентироваться. Если ELISA нацелен на белок непосредственно на бактериях или вирусах, они называются ELISA на антигены, тогда как, если мишенью является ответ антител животного на бактерии или вирусы, это называется ELISA на антитела. Хотя существуют анализы ELISA, предназначенные для определения только одного или двух белков (антител или антигенов), многие из них на самом деле нацелены на большое количество белков. Анализы также могут быть разработаны для выявления определенного типа ответа антител (IgG, IgM или IgA) или их комбинации. Каждый из этих типов антител имеет определенные функции, которые не входят в объем данной статьи.

Концепция и процесс обнаружения антител или антигенов с помощью ELISA точно такие же. Он начинается с получения целевого белка (антигена или антитела). Для отдельных белков необходим отдельный процесс для получения очищенной концентрации этого единственного белка. Определение того, на какой белок или белки нацеливаться, является научным и сложным процессом. В идеале анализ нацелен на один белок, который уникален для рассматриваемого патогена (не вступает в перекрестную реакцию с другими патогенами), обладает высокой иммуногенностью (для обнаружения антител) или обнаруживается в высоких концентрациях (для обнаружения антигена); он нацелен на белок, который, как известно, тесно связан с защитой от болезней и всегда присутствует. К сожалению, многие из этих критериев неизвестны, и вместо них часто используется этот единственный белок, который можно легко получить и обнаружить в образце, или смесь нескольких белков (т. е. целый вирус или бактерия). Хотя использование целых вирусов или бактерий в качестве белков-мишеней может быть простым, существует много возможностей для перекрестных реакций с другими патогенами.

Существуют общие этапы процесса (см. рис. 1)

• Шаг 1. Предварительно покройте микропланшет целевым антигеном(ами) (для обнаружения антител) или антителами (для обнаружения антигенов).
• Шаг 2. Добавьте образец для тестирования и инкубируйте, чтобы произошло связывание между антигеном и антителами.
• Шаг 3. Удалите образец и добавьте специальные антитела, которые присоединены к противоположной стороне антител (нижняя часть «Y» антитела для обнаружения антител) или антигена (верхняя часть «Y» для обнаружения антигена). Затем образец инкубируют, чтобы произошло прикрепление, и промывают, чтобы убедиться, что любые неприкрепляющиеся (т. е. нецелевые) антитела или антигены удалены.
• Шаг 4. Добавьте антитело, помеченное детектором, который может флуоресцировать и будет присоединяться к специальным антителам, добавленным на шаге 3 (прикрепите к нижней части «Y» части антитела; одна и та же мишень для обнаружения антигена или антитела). Затем образец снова инкубируют, чтобы произошло прикрепление, и промывают, чтобы убедиться, что все неприкрепившиеся меченые антитела удалены.
• Шаг 5. Добавьте реагент, который вызовет флуоресценцию оставшихся меченых антител, а затем дайте инкубироваться, чтобы обеспечить прикрепление.
• Этап 6. Образец считывается, обычно с помощью специального прибора на определенной длине волны для количественного определения изменения цвета (называемого абсорбцией). Существуют некоторые небольшие различия в этом процессе в зависимости от того, является ли анализ прямым, непрямым или сэндвич-ELISA, каждый из этих анализов имеет разные преимущества и недостатки (здесь не обсуждаются), но, в конце концов, все они дают одинаковые результаты; чем выше поглощение или изменение цвета, тем выше ожидаемая концентрация целевого антигена или антитела в тестируемом образце.

В случае конкурентного ELISA ключевым моментом является то, что используемый процесс фактически даст противоположный результат (см. Рисунок 2B). Образец и известное количество меченого антигена (для обнаружения антигена) или антител (для обнаружения антител) добавляют к анализируемому образцу, так что после добавления в лунки с меткой исходный образец и добавленные меченые белки ( антитела или антиген) конкурируют за прикрепление к предварительно покрытой лунке планшета. По сути, если в тестируемом образце нет целевых белков, то все меченые белки смогут прикрепиться к планшету и вызвать сильное изменение цвета. С другой стороны, если в образце имеется значительное количество белков-мишеней, белки из образца будут работать, чтобы превзойти (блокировать) прикрепление меченых белков. Когда образец промывается, любые несвязанные меченые белки удаляются путем промывания. Таким образом, чем больше антигенов или антител в образце, тем больше они будут блокировать меченые белки, что приводит к их отсоединению и вымыванию. Это приводит к низкому поглощению, когда концентрация целевых белков в образце высока, что противоположно предыдущему случаю. Высокие значения предполагают низкую концентрацию или отрицательный результат и делают невозможным количественное определение концентрации антигена/антитела в положительных образцах.

Пороговое значение для каждого анализа ELISA может быть разным и предварительно устанавливается производителем на основе желаемой целевой чувствительности и специфичности. Для прямого, непрямого или сэндвич-ИФА любое число выше порогового значения считается положительным. Для конкурентного ELISA любое число, превышающее пороговое значение, считается отрицательным. Для некоторых тестов они также устанавливают серую зону для классификации образцов как «подозрительных», поскольку анализ имеет тенденцию иметь некоторые «фоновые» реакции (перекрестные реакции), которые затрудняют определение четкой точки отсечки.

Результаты обычно, но не всегда, представляются в виде скорректированного отношения S:P или образца к положительному результату, которое скорректировано с учетом изменения цвета фона, обнаруженного в лунках отрицательного контроля. Часто уровни антител называют «титрами». Хотя это технически неверно, это можно оправдать с точки зрения общей картины. Ключевым моментом является то, что когда речь идет о титрах, существует прямая математическая зависимость между значениями (значение 20 имеет в два раза больше антител, чем образец со значением 10). Для значений ELISA такой прямой математической зависимости не существует (см. рис. 2А). ELISA со значением 2,0 действительно содержит значительно больше антител, а не только в два раза больше антител, чем значение 1,0.

Объединение образцов для анализа

Поскольку анализы ELISA зависят от концентрации (прямо коррелируют с концентрацией целевого белка [антитела или антигена]), настоятельно не рекомендуется объединять образцы для тестирования. Объединение может значительно увеличить вероятность пропуска положительного образца.

Несколько областей применения анализа ELISA:

• Обнаружение антител против целевого патогена – ИФА на антитела – Наиболее распространенное применение
• Определить контакт с патогеном
• Определить статус вакцинации животного
• Определить время заражения (изменение уровня антител) с течением времени.
• Обнаружение целевого патогена путем определения белка/антигена целевого патогена – ИФА для определения антигена.