ПЦР как диагностический инструмент (2/2): Использование и интерпретация результатов

Некоторые возможности применения ПЦР-анализа:

• Обнаружение ДНК/РНК целевого патогена – наиболее распространенное применение.
• Серотипирование патогена путем нацеливания на определенные гены (ДНК/РНК), о которых известно, что они различаются между серотипами (например, гены биосинтеза капсулы Actinobacillus pleuropneumoniae).
• Обнаружение наличия генов вирулентности (например, генотипирование E. coli)

Важно помнить, что анализы ПЦР определяют только присутствие целевого генетического материала на основе праймеров и не указывают, может ли организм быть инфекционным или нет. При тестировании генов анализ определяет только наличие гена, но не определяет, выделяет ли организм обнаруженный фактор вирулентности.

В последние годы в лабораториях была разработана мультиплексный ПЦР для одновременного тестирования нескольких патогенов или нескольких штаммов или генов одного и того же патогена. Эти мультиплексные ПЦР представляют собой несколько ПЦР, которые выполняются одновременно. Их стоимость выше, чем отдельных ПЦР, но значительно дешевле, чем отдельное проведение ПЦР, поскольку лаборатория значительно экономит на использовании оборудования, персонале лаборатории и использовании реагентов. Лаборатория будет использовать различные маркеры, чтобы определить, какие положительные результаты относятся к тем или иным праймерам. Часто эти мультиплексные ПЦР имеют смысл, например, при тестировании генотипирования E. coli, когда можно одновременно оценить около 14 генов на одном и том же бактериальном изоляте. Другим примером является одновременное тестирование на РРСС типа 1 и типа 2. Еще одна распространенная схема тестирования заключается в одновременном тестировании на эпидемическую диарею свиней и дельта-коронавирус свиней. Важно отметить, что разработка этих анализов не всегда проста, поскольку лаборатория должна убедиться, что между различными анализами ПЦР нет противодействия. Это означает, что циклические температуры и различные используемые праймеры не ингибируют и не вступают в перекрестную реакцию друг с другом. Каждая из этих мультиплексных ПЦР должна быть проверена перед использованием, что приведет к значительной оптимизации исследования.

Интерпретация результатов:

Одна из проблем, связанных с ПЦР-анализом, заключается в том, что часто каждая лаборатория использует свой протокол тестирования образцов, который может включать различия в процессе выделения ДНК/РНК, различия в протоколах циклирования, а также различия в используемых праймерах. Это может затруднить точное сравнение результатов, полученных в разных лабораториях.

Отрицательный результат

• Образец/поголовье действительно отрицательные на патоген
• Убедитесь, что для целевого патогена был представлен правильный образец. Несколько классических примеров для рассмотрения:
• • Вирус гриппа не распространяется системно и поэтому не обнаруживается в образцах крови.
  • Анализ ротовой жидкости на Mycoplasma hyopneumoniae редко дает положительный результат, поскольку возбудитель обычно прикрепляется к ресничкам ниже в дыхательной системе.
  • При отправке только 1 плода после аборта, вызванного РРСС (вероятность положительного результата только 50%), следует представить как минимум 4 плода, чтобы максимизировать шансы найти положительный образец.
• Образец взят слишком поздно после заболевания, возбудитель больше не присутствует.
• • Вирус гриппа присутствует в выделениях из носа только в течение первых 3-4 дней.
• Несоответствие праймера
• • Новый штамм РРСС
• Низкая распространенность в поголовье, отобранные животные не были инфицированы.
• • Необходимо значительно увеличить количество отобранных животных
• Разбавление слабоположительного образца из-за объединения
• • Объединение пероральных жидкостей, которые традиционно являются уже разведенными образцами (тестирование нескольких свиней и уже ожидаемые высокие значения Ct в положительных образцах)

Положительный образец

• Образец/поголовье действительно положительный на возбудитель
• Невозможно отличить инфекционный или неинфекционный образец
• В зависимости от целевого патогена обнаружение ДНК/РНК не всегда подтверждает заболевание.
• • ПЦР-положительная легочная ткань на Mycoplasma hyopneumoniae подтверждает присутствие микроорганизма в ткани, но не подтверждает серьезность или клиническую значимость возбудителя. Зачастую в поголовье (за исключением поголовья с отрицательным результатом на микоплазму) необходимо визуально подтвердить процент поражения легких (общая оценка) для определения клинической значимости результатов.
  • Сыворотка с положительным ПЦР-тестом на цирковирус свиней типа 2 (ЦВС-2) подтверждает наличие ЦВС-2, но не подтверждает, связаны ли истощение или пневмония с ЦВС-2 или имеет место неэффективность вакцины. Необходимо провести иммуногистопатологию легочной и/или лимфатической ткани, чтобы продемонстрировать заболевание, связанное с ЦВС-2.
  • Анализ может быть не в состоянии отличить вакцинный вирус/бактерию от модифицированной живой вакцины от инфекции дикого типа.
  • • Крайне важно знать время и тип используемой вакцины
    • Может потребоваться информация о секвенировании
• Перекрестное загрязнение при неправильном обращении с образцами
• • Особенно актуально при объединении образцов. Объединение следует проводить используя лабораторный колпак.
  • Образцы фекалий, собранные с пола, могут быть перекрестно загрязнены остатками патогена из окружающей среды.
• Низкие значения Ct связаны с высокой концентрацией вирусов/бактерий в образце и часто могут коррелировать с более высокой вероятностью ассоциирования с клиническим заболеванием.
• • Низкие значения Ct Lawsonia intracellularis в фекалиях, скорее всего, связаны с поражением кишечника.
  • • Ct < 20 → Пролиферативная энтеропатия свиней
    • Ct > 30 → Поражений кишечника не обнаружено

Генотипирование

• Использование ПЦР-генотипирования становится все более распространенным, особенно для E. coli. Он предоставляет эпидемиологическую информацию об изменениях в изолятах, влияющих на поголовье (например, грипп H1N1 по сравнению с H3N2).
• Часто результаты генотипирования используются при выборе вакцины для использования, например, с E. coli (подтверждающие пили).
• Важно помнить, что результаты представляют только один изолят, и часто свиньи заражаются несколькими изолятами одновременно.
• Обнаружение только подтверждает наличие генов вирулентности, но не подтверждает их экспрессию. Часто достаточно просто знать, что у него есть генетический потенциал для экспрессии гена.
• Поскольку стоимость и простота секвенирования генов продолжают снижаться, использование или потребность в генотипировании методом ПЦР будет уменьшаться.