Лабораторная диагностика: Репродуктивно-респираторный синдром свиней (РРСС)

Доступные анализы

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

• Обнаруживает наличие определенной последовательности вирулентной нуклеиновой кислоты (РНК).
• Типы образцов: ткани, кровь, сыворотка, ротовые жидкости, и т.д.
• Преимущества:
  • Одновременное использование различных праймеров для выявления РРСС типа 1 (европейский) и типа 2 (североамериканский) в одном образце
  • Очень высокая чувствительность (может выявить малейшее количество вируса).
  • Раннее выявление – острые формы заболевания должны быть положительными
  • Использование множества различных видов образцов (ткани, кровь, сыворотка, ротовые жидкости и т.д.)
  • Умеренная стоимость:
  • • Зачастую можно объединить 5 образцов сыворотки и ткани для снижения стоимости и минимизации потери чувствительности.
    • Часто не объединяют ротовые жидкост из-за ожидаемых высоких пороговых значений (пониженная концентрация вируса), что может привести к существенному снижению чувствительности.
• Недостатки:
• • Во избежание ложно негативных результатов лаборатории должны периодически обновлять праймеры.
    • Необходимо обновлять праймеры как для РРСС типа 1, так и типа 2.
  • Для дифференциации вакцинного и дикого вируса необходимо секвенирование.

Иммуноферментный анализ (ИФА)

• Обнаруживает наличие антител.
• Типы образцов: сыворотка и ротовые жидкости (для некоторых наборов)
• Преимущества:
• • Большинство наборов выявляют антитела как для РРСС типа 1, так и типа 2
  • Животные остаются положительными в течение нескольких месяцев (3-12).
  • Могут использоваться при хроническом заболевании
• Недостатки:
  • Выявление специфических антител и время выявления могут немного варьироваться в зависимости от доступных коммерческих наборов.
  • Для того, чтобы животные стали серопозитивными требуется 7-10 дней
  • Невозможно определить разницу между материнскими антителами и контактными.
  • Невозможно дифференцировать вакцинный и дикий вирус.

Иммуногистохимия (ИГХ)

• Выявляет наличие вирусного антигена
• Типы образцов: ткани
• Преимущества:
• • Выявляет вирус в месте поражения (хорошее доказательств причинно-следственной связи)
  • Может выявить низкую, среднюю или высокую концентрацию вируса.
• Недостатки:
• • Необходимо предоставить корректный образец ткани.
  • По сравнению с ПЦР для выявления необходимо большее количество вируса
  • Оценивает только маленький образец ткани.

Генетическое секвенирование

• Секвенирует генетические нуклеиновые кислоты вируса (РНК).
• Типы образцов: ткани, кровь, сыворотка, ротовые жидкости и т.д.
• Преимущества:
• • Могут дифференцировать вакцинный и дикий вирус
  • Может помочь дифференцировать новый появившийся вирус от существующего или прошлых вирусов.
• Недостатки:
• • Дорогой
  • Обычно секвенирует только ORF5, т.е. 600 из примерно 15 000 основных пар.
  • Образцы с высоким пороговым значением (> 34) сложнее секвенировать.

Таблица 1. Успешное секвенирование, основанное на методе расчета пороговых значений цикла ПЦР для РРСС из образца ротовых жидкостей. Таблица подготовлена Chris Rademacher и др. 2016.

Образец	Пороговые значения ПЦР	Общее количество исследуемых образцов	Кол-во секвенированных образцов	% Образцов с положительным секвенированием
Все образцы	<30	2016	2013	99.85
	30.00-31.99	389	361	92.80
	32.00-33.99	324	265	81.79
	34.00-35.99	185	109	58.92
	36.00-37.00	65	26	40.00

Косвенная иммунофлюоресценция (ИФА)

• Выявляет наличие антител
• Типы образцов: сыворотка
• Преимущества:
• • Наравне с ПЦР может выступать в качестве подтверждающего теста для неожиданных положительных результатов ИФА.
    
• Недостатки:
• • Невозможно для большого количества образцов
  • На результат влияет изолят вируса, использованный для анализа.
  • Надежность в большой степени зависит от технических навыков.

Интерпретация результатов

ПЦР

• Положительный – Вирус присутствует/циркулирует, что с высокой степени вероятности говорит о причинно-следственной связи, особенно при низких пороговых значениях и наличии клинических признаков. Недавняя вакцинация модифицированной живой вакциной может привести к положительным ПЦР результатам.
• Отрицательный – отсутствие вируса или отрицательный результат при наличии вируса, если тестирование проводится по прошествии большого количества времени после заражения.

ИФА

• Положительный – Материнские антитела или контакт в прошлом (обычно> 7-10 дней после контакта) с вакцинным или диким вирусом.
• Отрицательный – отсутствие вируса или для выявления прошло слишком мало времени после инфицирования (обычно должно пройти 7-10 дней после контакта).

ИГХ

• Положительный – вирус присутствует в месте поражения
• Отрицательный – отсутствие вируса либо отрицательный результат при наличии вируса, если тест проводится по прошествии большого количества времени после заражения.

Генетическое секвенирование

• Вакцинный вирус – ожидаемая гомология - > 99%
• Дикий вирус – ожидаемая гомология снижается на 1-2% в год.

ИФА

• Положительный - Материнские антитела или контакт в прошлом (обычно> 7-10 после контакта) с вакцинным или диким вирусом.
• Негативный - отсутствие вируса или для выявления прошло слишком мало времени после инфицирования (обычно должно пройти 7-10 дней после контакта).

Сценарии

Аборты у свиноматок/свинок

• Абортированные плоды: Соберите 6-8 плодов и проведите общий ПЦР анализ. Только около 50% абортированных плодов будут ПЦР-положительными (поэтому необходимо провести анализ большого количества плодов), но у положительных образцов обнаружится высокая концентрация вируса, поэтому их можно объединять в группы по 10 для ПЦР анализа
• Абортирующие свиноматки/свинки: Соберите сыворотку свиноматок/свинок, у которых недавно случился аборт (< 10 дней) для ПЦР анализа. Можно объединить в группы по 5. ИФА-анализ будет бесполезен, так как обычно для того, чтобы стать серопозитивными наивным свиноматкам/свинкам требуется 7-9 дней.

Репродуктивные проблемы у свиноматок/свинок

• Соберите 15-20 образцов от животных с репродуктивными проблемами и 15-20 от животных, у которых данные проблемы отсутствуют и протестируйте с помощью ПЦР (можно объединить 5-6 образцов) или ИФА (каждый по отдельности).

Слабые поросята при опоросе

• Можно собрать семейные ротовые жидкости от слабых поросят нескольких пометов и протестировать с помощью ПЦР.
• Можно собрать тестикулы (если кастрируются), хвосты, ткани языка (мертвые поросята) от поросят из различных пометов. Для тестирования можно объединять большое количество образцов.
• Соберите образцы сыворотки от 10 пораженных пометов отобрав 2-3 поросенка из помета и протестируйте с помощью ПЦР, объединив 5-6 поросят. Убедитесь, что поросята не вакцинировались против РРСС.

Поросята на доращивании с острыми клиническими признаками РРСС

• Соберите ротовые жидкости с 4-6 различных станков и протестируйте индивидуально с помощью ПЦР. Не объединяйте образцы для тестирования.
• Соберите 15-30 рандомных образцов сыворотки от поросят с клиническими признаками и протестируйте с помощью ПЦР. Для анализа можно объединить в группы по 5-6.

Поросята на доращивании с хроническими признаками РРСС

• Соберите ротовые жидкости с 4-6 различных станков и протестируйте индивидуально с помощью ПЦР. Не объединяйте образцы для тестирования. Можно также использовать ИФА-анализ
• Соберите 30 рандомных образцов сыворотки от поросят с клиническими признаками и протестируйте с помощью ПЦР. Для анализа можно объединить в группы по 5-6. Для подтверждения контакта можно использовать индивидуальное тестирование образцов с помощью ИФА-анализа.