РРСС диагностика: Соотношение стратегий с вашими сценариями

Методы диагностики РРСС с годами развивались и сейчас включают несколько вариантов тестирования. Тип животных, от которых планируется отбор образцов и сама процедура зависят от сценария, для которого проводится тестирование: Следует ли тестировать свиноматок, поросят, свиней на откорме или их всех? Мы проводим целевой отбор среди поголовья или случайный? Каким должно быть количество для выборки? Также следует определиться с типом выборки: Мы отбираем плазму, ткани, ротовые жидкости и семя? И, наконец, не следует забывать о всех вопросах, связанных со стадией болезни при отборе образцов. Когда появились клинические признаки и обнаружит ли диагностический тест вирус, определит ли он поражения и антитела? И, наконец, чрезвычайно важно понимать преимущества и ограничения каждого диагностического теста.

Понимание вариантов и выбор корректной диагностической стратегии для каждого сценария, при котором нам необходимо провести выборку по РРСС, повысит эффективность любой программы по работе со здоровьем в поголовье.

Сценарии, при которых мы проводим выборку по РРСС

Наиболее очевидный сценарий - определение болезни при появлении симптомов, говорящих о потенциальной вспышке РРСС на негативной по РРСС ферме. В этом случае для понимания причины клинических симптомов и происхождения патогена, вызывающего проблемы, ветеринары проводят тесты. Другой достаточно распространенный сценарий – когда проводится мониторинг РРСС на положительной в прошлом ферме с нестабильным поголовьем, где применили стратегию по контролю и уничтожению болезни и хотят понять прогресс применяемых действий. Наконец, тестирование на РРСС чрезвычайно распространено с целью исследования болезни. В последнем сценарии тестирование проводится на негативных фермах и обычно требует большого количества образцов для достижения максимальной степени уверенности в статусе фермы с поголовьем, свободным от РРСС.

Наши диагностические цели определяют выбор теста

Исторически мы выделяем 3 типа диагностических теста для РРСС:

1. Определяющие поражения: Вскрытие и гистология, которые проводятся только в лабораториях и под микроскопом. Тесты, определяющие поражения, наиболее часто используются на ранних стадиях при клинически очевидных вспышках РРСС;
2. Определяющие вирус: полимеразная цепная реакция (ПЦР), выделение вируса и иммуногистохимические тесты. Определение вируса – это наиболее надежный диагностический инструмент для раннего подтверждения наличия вируса;
3. Определяющие антитела: иммуноферментный твердофазный анализ (ИФА), иммунопероксидазный монослойный анализ (IPMA) и непрямая иммунофлюоресценция. Иммунологическое подтверждение контакта с вирусом РРСС требует более длительного периода, но подтверждает воздействие, когда вирус не может быть обнаружен.

Характеристики теста определяют его ценность

При выборе диагностического теста чрезвычайно важно обратить внимание на его ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ и СПЕЦИФИЧНОСТЬ. Эта информация помогает правильно интерпретировать результаты и определить дальнейшие действия.

• ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ — это способность диагностического теста корректно идентифицировать истинно позитивные образцы. Тест с низкой ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬЮ приведет к появлению слишком большого количества ложно негативных результатов.
• СПЕЦИФИЧНОСТЬ — это способность диагностического теста корректно идентифицировать истинно негативные образцы. Тест с низкой СПЕЦИФИЧНОСТЬЮ приведет к появлению слишком большого количества ложно позитивных результатов.

Варианты диагностики по сценариям РРСС

Все сценарии и варианты диагностики представлены в Таблице 1.

1. Изучение вспышки: Для фермы, где произошла вспышка целью диагностического протокола будет подтверждение инфекции и, при возможности, генетическая характеристика штамма. Привлечение ветеринаров на ранней стации вспышки поможет достигнуть этих целей более эффективно. Если есть свиньи с классическими клиническими симптомами, то настоятельно рекомендуется провести целевую выборку среди этих животных для поиска повреждений. После определения характеристик поражений (т.е. тяжелые, не разрушенные легкие с мраморным рисунком) на ферме, следует провести ПЦР и гистопатологические исследования для подтверждения диагноза. Затем, для определения штамма необходимо провести генетическое секвестирование. Секвенирование - это ключ к пониманию эпидемиологии (т.е. происхождения, резидентства или появления) потенциально нового вируса через сравнение с другими известными штаммами.

2. Мониторинг болезни: На позитивной по РРСС ферме для минимизации негативного влияния болезни, вызывающей нестабильность производства, необходимо внедрить программы по контролю заболевания, чтобы в кратчайшие сроки начать производить негативных поросят. Целями диагностической программы в этом случае станет демонстрация ключевых параметров, которые определяют стабильность по РРСС (т.е. акклиматизация свинок, иммунитет племенного стада, производство негативных поросят). Серология используется для подтверждения контакта у свинок и племенного поголовья, а ПЦР для подтверждения отсутствия вируса у новорожденных поросят и у отъемышей. В этом случае мы применяем тесты с высокой ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬЮ (т.е. как можно меньше ложно негативных результатов). Так как мы имеем дело с фермой, где, как ожидается, количество РРСС-позитивных поросят очень низкое или отсутствует, большое количество образцов потребует подтверждения статуса по РРСС с большей степенью достоверности. Учитывая отсутствие клинически болеющих поросят, случайная выборка поросят и вновь прибывшие негативные свинки будут нашей целевой выборкой для отбора образцов. Большинство из типов образцов (плазма, ротовые жидкости и ткани) являются ценными, но при оценке результатов важно понять разницу между ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬЮ и СПЕЦИФИЧНОСТЬЮ тестов. Чтобы сделать анализы более доступными, всегда следует брать в расчет группировку.

3. Исследование болезни: При проведении исследования на негативных фермах, мы обычно выбираем тесты с самой высокой СПЕЦИФИЧНОСТЬЮ (т.е. как можно меньше ложно позитивных результатов). Эти фермы (т.е. центры осеменения и мультипликации) во многих случаях требуют документального подтверждения их статуса на регулярной основе. На репродукторах ИФА диагностика является самым хорошим вариантом для доказательства отсутствия контакта с РРСС. Она доступна, быстро дает результаты и имеет высокую ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ и СПЕЦИФИЧНОСТЬ. Обычно на фермах распространено проведение вторичного серологического теста для определения внезапных позитивных результатов (обычно 1-2% от общего количества образцов) как истинных или ложно положительных. Непрямая иммунофлюоресценция антител или иммунопероксидазный монослойный анализ (IPMA) основываются на непрямом окрашивании предварительно подготовленных монослоев зараженной клетки и выполняют роль подтверждающих тестов для внезапных позитивных по ИФА результатов. ПЦР в качестве раннего определения используется для: 1) ротовых жидкостей до отправки свинок и племенных ремонтных свинок и 2) плазмы или крови хряков в центрах осеменения.

Вкратце, выбор корректных тестов в корректное время у корректной группы животных и их правильная интерпретация увеличат скорость, точность и эффективность наших диагностических стратегий по РРСС.

Таблица 1. Коротко о сценариях и стратегиях диагностики

Расследование вспышки

1. Статус фермы по РРСС

• Нестабильная
• Активный перенос вируса
• Новое появление РРСС
• Высокая распространенность болезни

2. Цели диагностики

• Определение инфекции
• Идентификация штамма вируса РРСС

3. Животные

• Животные с клиническими симптомами
• Мертворожденные поросята

4. Тип отбора образцов

• Целевая выборка
• Небольшое количество животных
• Групповая выборка

5. Образцы

• Ткань
• Плазма

6. Основной вариант диагностики

• Вскрытие для подтверждения поражения
• Преимущества

«Очень быстро»

Происходит на ферме

Недорого

• Недостатки

Низкая ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ/СПЕЦИФИЧНОСТЬ

7. Дополнительный вариант диагностики

• ПЦР/Секвенирование вируса для определения/идентификации штамма вируса РРСС
• Преимущества

Высокая ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ/СПЕЦИФИЧНОСТЬ

Быстро, 24 часа

Результаты можно количественно измерить (кПЦР-РВ)

• Недостатки

Потенциально ложно позитивные результаты из-за перекрестного заражения: Необходимо обеспечить надлежащую процедуру отбора образцов (как во время отбора, так и при обработке).

Мониторинг болезни

1. Статус фермы по РРСС

• Стабильная
• Резидентный вирус РРСС
• Низкая распространенность болезни

2. Цели диагностики

• Мониторинг стабильности/контроль
• Мониторинг программ по ликвидации

3. Животные

• Поросята (новорожденные и отъемыши)
• Свинки

4. Типы выборки

• Случайная выборка/Большое количество животных
• Целевая выборка/Небольшое количество животных
• Групповая выборка

5. Образцы

• Ротовые жидкости
• Плазма
• Производственные жидкости
• Жидкость из языка поросенка

6. Основной вариант диагностики

• ПЦР для определения антигена (РНК) примерно на 7ой день после заражения
• Преимущества

Высокая ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ/СПЕЦИФИЧНОСТЬ

Быстро, 24 часа

Результаты можно количественно измерить (кПЦР-РВ)

• Недостатки

Потенциально ложно позитивные результаты из-за перекрестного заражения: Необходимо обеспечить надлежащую процедуру отбора образцов (как во время отбора, так и при обработке).

7. Дополнительный/Альтернативный вариант диагностики

• ИФА для определения антител (IgM, IgG, N) примерно на 14 день после инфицирования
• Преимущества

Низкая стоимость на образец

Результаты через 2-4 дня

Подтверждает лабораторную историю отсутствием контакта с вирусом

• Недостатки

Пониженная СПЕЦИФИЧНОСТЬ

Не может различить вакцину и полевой вирус

Результаты не измеряются количественно

Исследование болезни

1. Статус фермы по РРСС

• Негативная по РРСС ферма

2. Цели диагностики

• Обеспечить негативный статус фермы

3. Животные

Свиноматки Свинки/Поросята Ремонтные свинки 4. Виды выборки Случайная выборка Большое количество животных Групповая выборка	Хряки для искусственного осеменения 4. Виды выборки Случайная выборка Большое количество животных Групповая выборка Целевая выборка
5. Образцы Плазма Веревки	5. Образцы Плазма Мазки крови
6a. Основной вариант диагностики (свиноматки, свинки и поросята) ИФА для определения антител (IgM, IgG, N) примерно на 14 день после инфицирования Преимущества Низкая стоимость на образец Результаты через 2-4 дня Подтверждает лабораторную историю отсутствием контакта с вирусом Недостатки Пониженная СПЕЦИФИЧНОСТЬ Не может различить вакцину и полевой вирус Результаты не измеряются количественно 6b. Основной диагностический вариант (свиноматки, свинки и поросята) ПЦР для определения антигена (РНК) через 72 часа после контакта Преимущества Высокая ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ/СПЕЦИФИЧНОСТЬ Быстро, 24 часа Результаты можно количественно измерить (кПЦР-РВ) Недостатки Потенциально ложно позитивные результаты из-за перекрестного заражения: Необходимо обеспечить надлежащую процедуру отбора образцов. 7. Вспомогательный вариант диагностики Иммунопероксидазный монослойный анализ (IPMA) и непрямая иммунофлюоресценция (IgM, IgG) примерно через 14 дней после заражения Преимущества Высокая СПЕЦИФИЧНОСТЬ Результаты через 4 дня Подтверждение результатов ИФА теста Результаты можно количественно измерить Недостатки Вариативная ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ Результаты зависят от навыков сотрудников лаборатории	6. Основной вариант диагностики ПЦР для определения антигена (РНК) через 72 часа после контакта Преимущества Высокая ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ/СПЕЦИФИЧНОСТЬ Быстро, 24 часа Результаты можно количественно измерить (кПЦР-РВ) Недостатки Потенциально ложно позитивные результаты из-за перекрестного заражения: Необходимо обеспечить надлежащую процедуру отбора образцов (как во время отбора, так и при обработке).