Diagnóstico molecular da PRRS: quando a sequenciação de apenas 4% não é suficiente

O vírus da síndrome reprodutiva e respiratória dos suínos (vPRRS) é, juntamente com o vírus da Peste Suína Africana, um dos agentes patogénicos com maior impacto económico na indústria suinícola mundial. O recente aparecimento de estirpes muito agressivas de vPRRS, como o vPRRS altamente patogénico (HP-vPRRS) na Ásia, o Rosalia na Europa e o L1C.5 na América do Norte, suscitou o debate sobre a necessidade de melhorar o diagnóstico e o controlo do vPRRS.

A utilização de RT-PCR para detectar o material genético do vPRRS é utilizada por rotina em todo o mundo para rastrear populações para o vírus.

Um passo para além da detecção do ARN é a sequenciação genética do vPRRS, que é geralmente efectuada utilizando a técnica de Sanger. A nível mundial, a porção do vírus mais utilizada para a sequenciação do vPRRS é a ORF5, embora alguns laboratórios produzam relatórios com a sequenciação da ORF7.

A ORF5 representa cerca de 4% e a ORF7 2,4% do genoma do vPRRS e, por conseguinte, não fornece uma cobertura genética completa de todo o genoma.

Nos últimos anos, tem havido um interesse crescente na utilização da Sequenciação de Nova Geração (NGS) para a recuperação de genomas completos de vPRRS para investigações epidemiológicas numa exploração ou sistema de produção (Figura 1).

Durante o processo de replicação, o vPRRS sofre alterações e mutações genéticas, que podem potencialmente levar ao aparecimento de novas variantes do vírus. Sabe-se que o vPRRS tem uma elevada taxa de mutação, aproximadamente 0,5-1% por ano, distribuída de forma desigual em diferentes regiões do genoma, diferentes tipos de vírus e linhagens genéticas, o que leva a uma evolução genética constante. Em particular, a mutação e a evolução genética do vírus podem ocorrer em todos os genes, pelo que a sequenciação de apenas uma parte do genoma, por exemplo, ORF5 ou ORF7, é susceptível de não permitir a detecção de alterações que ocorram fora da região sequenciada (figura 1).

Neste cenário, o NGS torna-se uma ferramenta útil ao proporcionar a oportunidade de recuperar um genoma completo do vPRRS para utilização na investigação epidemiológica.

Como é que os veterinários e os produtores podem tirar partido do NGS?

Para maximizar a utilidade dos NGS, há que ter em conta uma série de pontos:

• É importante que o veterinário e o laboratório de diagnóstico estejam envolvidos desde o início para alinhar o diagnóstico diferencial, as expectativas e a abordagem dos testes.

• Temos uma sequência completa do genoma de uma estirpe de referência do vírus da PRRS da exploração ou do sistema de produção para comparação?

  • Caso contrário, utilize o NGS em amostras positivas para a RT-PCR do vPRRS com valores Ct baixos, ou seja, idealmente <24, para recuperar um genoma completo como estirpe de referência da exploração. O valor Ct está inversamente relacionado com o número de cópias do gene do vírus presentes na amostra, ou seja, quanto mais baixo for o Ct, maior será a carga viral esperada e o sucesso do NGS;

  • Uma estirpe de referência permite a comparação subsequente de genomas recuperados prospectivamente para compreender a evolução genética do vPRRS na exploração, no fluxo e no sistema.

• Qual é a finalidade da realização de um NGS?

  • Se o objectivo for detectar a evolução do vírus a nível do genoma completo, devem ser colhidas amostras de pulmão e de soro, uma vez que estas amostras têm maior probabilidade de recuperar um genoma completo.

  • Se o objectivo for compreender a diversidade de vírus numa exploração, utilizar tipos de amostras populacionais, como fluidos de processamento, fluidos orais ou amostras individuais combinadas, por exemplo, as amostras de soro combinadas têm maior probabilidade de recuperar múltiplos vírus se estes estiverem presentes na amostra.

  As infecções mistas com dois ou mais vírus PRRS numa exploração são uma realidade (figura 2a) e, se os dois vírus forem muito semelhantes, o NGS pode não recuperar um genoma completo;
  • Se estiverem presentes vários vírus na amostra, o NGS pode recuperar fragmentos do genoma, conhecidos como "contigs", de diferentes vírus, que, quando comparados com uma estirpe de referência da exploração, podem ajudar a discernir se estão presentes vários vírus na amostra (Figura 2b);
• Por fim, certifique-se de que tem alguém para o ajudar com as análises e comparações genéticas e coordene o tempo de resposta, uma vez que o NGS é frequentemente um processo lento que pode demorar mais de uma semana a concluir.

Que tipo de informações epidemiológicas podemos obter com o NGS?

Os resultados gerados pelo NGS podem ajudar a responder a questões como:

1. Ovírus evoluiu por substituições aleatórias de nucleótidos nas mesmas posições genómicas? Em que medida o vírus se alterou entre dois momentos e em que regiões do genoma, ou seja, regiões ORF, ocorreram essas alterações?

2. O vírus evoluiu por inserções ou supressões no seu genoma?

3. Houve uma nova introdução de um vírus não relacionado na exploração ou no fluxo?

4. Embora menos provável, mas possível, será que o novo vírus adquiriu alterações nas regiões genómicas alvo da RT-PCR ou da sequenciação Sanger primer/probe, fazendo com que os testes não detectassem o vírus?

5. O vírus sofreu recombinação, ou seja, adquiriu algumas regiões genómicas de dois ou mais vírus parentais?

A recombinação é um processo natural da evolução do vPRRS e ocorre quando dois vPRRS se replicam na mesma célula, gerando um terceiro vírus derivado. A recombinação será mais explorada num próximo artigo publicado no site.