Diagnóstico laboratorial: vírus da gripe tipo A (IAV)

Testes disponíveis

Pode ser benéfico rever o excelente resumo fornecido no artigo sobre a gripe de Phil Gauger:

Patologia macroscópica

• Avalia a presença de lesões nos tecidos que podem sugerir a presença de doença.
• Localização das lesões:
  Consolidação cranioventral (especialmente nos lobos apical e cardíaco).

• A apresentação pode ser difusa, abrangendo várias áreas do pulmão.
• Pode estar presente edema interlobular.

• Prós:
  • A gravidade da lesão pode ser relacionada com o significado clínico.
• Contras:
  • Lesões macroscópicas não diagnósticas (muito semelhantes às do Mycoplasma hyopneumoniae).
  • Estão frequentemente presentes infecções secundárias ou co-infecções

Histopatologia

• Avalia a presença de lesões que podem confirmar a presença de doença.
• Tipo de amostra: tecido pulmonar.
• Prós:
  • A bronquiolite necrosante é frequentemente considerada patognomónica da infeção pelo vírus da gripe A nos suínos.
  • As lesões características aparecem alguns dias após a disseminação do vírus nos suínos, especialmente quando estão presentes co-infecções.
• Contras:
  • Avalia apenas uma pequena quantidade de tecido
  • As lesões não complicadas podem resolver-se rapidamente (5-7 dias)

Imunohistoquímica (IHC)

• Detecta a presença de antigénio viral.
• Tipo de amostra: tecido pulmonar.
• Prós:
  • Detecta o vírus no local da lesão (boa evidência de causalidade)
  • O antigénio alvo é normalmente uma nucleoproteína que é conservada em todos os vírus da gripe A.
• Contras:
  • Avalia apenas uma pequena quantidade de tecido
  • O vírus só está presente durante um curto período de tempo (alguns dias)
  • Requer a presença de uma quantidade significativamente maior de vírus do que a PCR

Isolamento do vírus

• Isola o vírus vivo.
• Tipos de amostras: tecido pulmonar, lavagem broncoalveolar, esfregaços nasais.
• Prós:
  • Critério de referência.
  • Isolamento do vírus para utilização no desenvolvimento de vacinas (vacinas autógenas) ou em testes serológicos (inibição da hemaglutinação) para determinar a protecção cruzada.
• Contras:
  • Caro
  • Resultados lentos
  • Requer ovos de galinha embrionados ou células renais caninas de Madin-Darby (MDCK).
  • O processo de inoculação é muito trabalhoso
    frequentemente difícil de cultivar (muitos falsos negativos)
  • O manuseamento das amostras do campo para o laboratório pode afectar a sobrevivência do vírus

Reacção em cadeia da polimerase (PCR)

• Detecta a presença de uma sequência específica de ácido nucleico viral (ARN)
• Tipos de amostras: esfregaços nasais, fluidos orais, tecido pulmonar, lavagem broncoalveolar.
• Prós:
  • Os primers (iniciadores) podem ser desenhados para:
    • Detecção de todos os subtipos de vírus da gripe A - dirigido à nucleoproteína conservada
    • Detecção de grupos de virus de subtipos específicos: subtipo H1, H3, N1 ou N2
  • Alta sensibilidade
  • Detecção precoce
  • A quantificação por PCR está associada à presença de lesões
  • Custo moderado
    • As amostras de esfregaços ou de tecidos podem frequentemente ser combinadas para reduzir os custos e minimizar a perda de sensibilidade (especialmente no que respeita à relevância clínica).
• Contras:
  • Alta sensibilidade - especialmente em fluidos orais pode detectar a presença de pequenas quantidades de vírus na exploração, tornando difícil a interpretação clínica dos resultados no que diz respeito à extensão ou gravidade da doença.
  • O vírus só está presente no hospedeiro durante alguns dias (3-5 dias, especialmente em esfregaços nasais).
  • As amostras de sangue ou de soro não podem ser utilizadas para o teste PCR, uma vez que o vírus permanece no pulmão e não é sistémico.

Sequenciação genética

• Sequência segmentos do gene do ácido nucleico (ARN) do vírus.
• Tipos de amostras: tecido pulmonar, esfregaços nasais, lavagem broncoalveolar, fluidos orais.
• Prós:
  • Permite a diferenciação entre subtipos em muitos níveis diferentes de clados
    • H1: dividido em clados que são normalmente designados com o alfabeto grego (alfa, beta, gama, etc.)
    • H3: dividido em clusters que são normalmente designados por números romanos (I, IV, etc.)
    • Muitos destes clados ou clústers relevantes estão aqui descritos.
  • Pode ajudar a diferenciar a introdução de novos vírus dos vírus existentes ou passados.
  • Pode ajudar a seleccionar estirpes de vacinas com base no subtipo/clado.
• Contras:
  • Caro
  • Normalmente, apenas o gene HA é sequenciado
  • A variabilidade entre subtipos/clados continua a aumentar e está a tornar-se mais complexa

Ensaio por imunoabsorção ligado a enzimas (ELISA)

• Detecta a presença de anticorpos.
• Tipo de amostra: soro.
• Prós:
  • Os testes ELISA podem ser concebidos para:
    • Detecção de anticorpos de todos os subtipos - dirigidos à nucleoproteína conservada
    • Detecção de anticorpos específicos de subtipos - dirigidos às proteínas específicas hemaglutinina (designada por H ou HA) e/ou neuraminidase (designada por N ou NA).
  • Os animais permanecem positivos durante várias semanas (começa a diminuir após 8-10 semanas)
  • Pode ser utilizado em casos crónicos
• Contras:
  • Os anticorpos específicos e o momento da detecção podem variar ligeiramente entre os diferentes kits comerciais disponíveis.
  • Os animais demoram 10-14 dias a tornar-se seropositivos
  • Não distingue entre vacinação e infecção por vírus no terreno
  • Não identifica um subtipo específico de vírus

Ihibição da hemaglutinação (HI)

• Detecta a presença de anticorpos.
• Tipo de amostra: soro.
• Prós:
  • Os animais permanecem positivos durante várias semanas
  • Pode ser utilizado em casos crónicos
  • Pode ser utilizado para determinar o momento da vacinação para evitar a interferência de anticorpos maternos
  • Pode ser utilizado para determinar a proteção cruzada entre estirpes
• Contras:
  • Cada teste é específico da estirpe
  • Requer o isolamento da estirpe específica para avaliar a protecção cruzada
  • Demora 10-14 dias para que os animais se tornem seropositivos
  • Não distingue entre vacinação e infecção por vírus no terreno

Interpretação de resultados:

Patologia macroscópica

• Positivo: Confirmação da presença de pneumonia.
• Negativo: Os casos iniciais podem não apresentar lesões pulmonares extensas.

Histopatologia

• Positivo: Confirmação da doença.
• Negativo: Negativo ou as lesões não são detectadas se o teste for incorrecto ou muito tempo após a infecção.

IHC

• Positivo: O vírus está presente no local da lesão.
• Negativo: Negativo ou o vírus não é detectado se o teste for realizado muito tempo após a infecção ou se a concentração do vírus for demasiado baixa (apenas presente durante um curto período de tempo).

Isolamento do vírus

• Positivo: Confirmação da doença.
• Negativo: O vírus não é detectado se o teste for efectuado muito tempo após a infecção ou simplesmente não pode crescer devido a outra contaminação ou manuseamento incorrecto (presente mas muito difícil de cultivar).

PCR

• Positivo: Confirmação da doença.
• Negativo: Negativo, o vírus não é detectado se o teste for realizado muito tempo após a infecção ou devido a uma selecção ou manuseamento incorrectos da amostra.
• Inconclusivo: Pouco vírus presente ou co-infeção com mais do que um subtipo.

Sequenciação genética

• Permite identificar o subtipo e clado do vírus.
• Permite ajustar a estipe vacinal para uma melhor protecção.

ELISA

• Positivo: Anticorpos maternos ou exposição anterior (> 2 semanas) à vacina ou ao vírus selvagem.
• Negativo:
  • Negativo à vacina ou ao vírus selvagem.
  • Infecção demasiado recente para ser detectada (10-14 dias para seroconversão)
  • Incompatibilidade entre o teste e o vírus (subtipo ou clado)

HI

• Positivo: Anticorpos maternos ou exposição anterior (> 2 semanas) à vacina ou ao vírus selvagem.
• Negativo:
  • Negativo à vacina ou ao vírus selvagem.
  • Infecção muito recente para ser detectada (10-14 dias para seroconversão)
  • Incompatibilidade (subtipo ou clado) entre o vírus utilizado no teste e o vírus que infecta o suíno.

Cenários

Porcos de engorda com espirros e sinais respiratórios (agudos ou crónicos):

• Recolher 2-4 amostras de fluido oral do conjunto e efectuar a análise por PCR.
• Recolher 12 esfregaços nasais de suínos infectados com sinais clínicos (com corrimento nasal claro), fazer 3 grupos de 4 amostras cada e analisar por PCR.
• Efetuar a sequenciação de uma amostra PCR positiva para melhor determinar o grupo/clado.

Determinação do momento de exposição e possível necessidade de vacinação:

• Recolher amostras de 10-15 suínos às 3, 6, 9 e 12 semanas de idade.
• Duas abordagens para a colheita:
  • Transversal - recolha de amostras de diferentes grupos etários ao mesmo tempo (obtenção de resultados mais rápidos).
  • Longitudinal - recolha dos mesmos suínos ao longo do tempo (resultados mais exactos).
  • Análise de amostras de soro por ELISA.
• Recolher 2-4 amostras de fluido oral do grupo e analisar por PCR.
• Sequenciar uma amostra PCR positiva de cada grupo etário para melhor determinar o agrupamento/clado.