O teste ELISA como instrumento de diagnóstico (2/2): Interpretar os resultados

Considerações ao interpretar os resultados:

• Os porcos expostos a um agente patogénico (de campo ou vacinal) levam tempo a produzir anticorpos suficientes para serem detectados por ELISA (geralmente pelo menos 2-4 semanas após a exposição, dependendo do agente patogénico e do anticorpo que procuramos).
• Os testes de anticorpos ELISA não conseguem diferenciar entre anticorpos maternos (passivos) e anticorpos mediados pela exposição (activos).
• Os anticorpos ELISAs muitas vezes não conseguem diferenciar os anticorpos produzidos por uma vacina dos produzidos pela exposição a uma estirpe de campo.
• Em alguns casos, podem ser desenvolvidos testes especiais ELISA, que permitem a diferenciação entre animais infectados e vacinados (se forem utilizadas vacinas DIVA).
• Os resultados dos anticorpos ELISA não implicam protecção. A protecção pode vir de diferentes anticorpos, que não são necessariamente os medidos no teste, ou da imunidade mediada por células, que é completamente diferente da imunidade humoral, ou mediada por anticorpos, e não é medida por um teste ELISA.
• O antigénio ELISA é significativamente menos sensível (baixa sensibilidade analítica) na detecção de antigénios em comparação com uma PCR. A PCR replica activamente o ADN/RNA presente, para que possa detectar quantidades extremamente baixas de vírus ou bactérias. Por outro lado, o antigénio ELISA requer uma concentração significativamente mais elevada de vírus ou bactérias para poder criar uma mudança de cor detectável.
• Ao utilizar ELISAs comerciais (fáceis de encontrar e utilizar), os resultados são normalizados e geralmente consistentes entre laboratórios. Os testes ELISA internos podem produzir uma grande variabilidade de resultados, a menos que o seu protocolo de produção seja altamente normalizado e rigorosamente seguido.
• Nem todos os agentes patogénicos produzem uma resposta imunitária mensurável.
• Tipicamente, diferentes kits ELISA analisarão proteínas diferentes, que podem produzir resultados muito diferentes para a mesma amostra. Um exemplo claro são as grandes diferenças nos kits de detecção de anticorpos para Mycoplasma hyopnemoniae; claramente, nem todos os kits são criados de forma igual.
• A dose e/ou via de exposição pode afectar o nível de resposta imunitária (nível de produção de anticorpos).
• É importante conhecer a sensibilidade do teste (capacidade de detectar verdadeiros positivos) e a sua especificidade (capacidade de identificar verdadeiros negativos como negativos; sem reactividade cruzada).
  Podem ocorrer falsos positivos e falsos negativos porque a quantidade de exposição e resposta imunitária a agentes patogénicos varia entre porcos individuais (distribuição normal) e há frequentemente antecedentes ou reactividade cruzada que não podem ser completamente eliminados (ver figura 1).
• Os anticorpos ainda estão normalmente presentes/detectáveis durante vários meses após a exposição/vacinação.

Resultados negativos

• Amostra/exploração realmente negativa para o agente patogénico (sem exposição ou vacinação).
• A amostra da exploração é verdadeiramente negativa para o agente patogénico, embora os animais possam ter sido vacinados (se o teste tiver capacidade DIVA) (apenas ELISA para anticorpos)
• Não há antigénio suficiente presente na amostra para a detecção (apenas teste ELISA de antigénio)
• A amostra foi colhida demasiado cedo e o porco ainda não foi capaz de gerar uma resposta imunitária (apenas anticorpos ELISA).
  • PRRS requer frequentemente 7-10 dias para a seroconversão
  • A Lawsonia intracellularis requer frequentemente 4-6 semanas para a seroconversão, dependendo da dose de exposição
• Amostra tirada demasiado tarde e o agente patogénico já não está presente
  Vírus da gripe apenas presente nas secreções nasais durante os primeiros 3-4 dias
• Estamos à procura do anticorpo/antigénio errado
  • Diferentes estirpes de gripe (diferenças entre H1N1 e H3N3 e também entre diferentes clades de H1N1)
• Baixa prevalência na exploração e animal(is) amostrado(s) foi negativa
  • Necessidade de aumentar o número de animais amostrados
  • Uma determinada doença pode não estimular anticorpos suficientes para a detecção
  • Mycoplasma hyopneumoniae adere principalmente à cílios pulmonares e não estimula a produção elevada de IgG sérica
  • Infecção de campo recente produz resultados muito mais fortes com ELISA.
  • As vacinas contra Mycoplasma hyopneumoniae não estimulam uma forte resposta imunitária IgG
• Diferentes testes ELISA detectam vacinas de forma diferente
  • Tipicamente, apenas 30% dos animais vacinados são seroconvertidos
  • Uma amostra fracamente positiva será diluída se for combinada com outras amostras.
• É fortemente recomendado NÃO juntar amostras!

Amostra positiva

• Amostra/exploração realmente positiva para exposição ao agente patogénico
• Incapaz de diferenciar se a amostra é infecciosa ou não-infecciosa
• Incapaz de diferenciar os anticorpos maternos da exposição natural ou da vacinação.
  • A maioria dos anticorpos maternos desaparecem às 8-12 semanas de idade
  • À medida que os porcos envelhecem, os valores ELISA devem reduzir-se significativamente.
  • Podem ser feitos testes em série para confirmar o desaparecimento de anticorpos maternos, bem como a falta de exposição a estirpes de campo (sem novas infecções).
• Dependendo do agente patogénico que procuramos, a detecção da proteína (antigénio/anticorpo) nem sempre confirma a doença.
  • Soro que testa positivo para o vírus de circulação suíno tipo 2 (PCV2) por anticorpos ELISA confirma a exposição ao PCV2, seja por vacinação ou infecção (ambos os casos são bastante frequentes) mas não confirma se a deficiência é atribuível ao PCV2 ou se ocorreu uma falha de vacina. A imunohistopatologia do tecido pulmonar e/ou linfóide deve ser realizada para demonstrar a doença associada ao PCV2.
• O teste pode não ser capaz de diferenciar a exposição a vírus/bactérias vacinais de uma vacina viva modificada de uma infecção de campo (apenas anticorpos ELISA).
  • Aplicável tanto a vacinas vivas mortas como a vacinas vivas modificadas.
  • O tempo de aplicação da vacina é útil, embora não crítico, pois os animais podem permanecer positivos para algumas doenças durante um longo período de tempo (muitos meses).
• As contaminações cruzadas são improváveis, uma vez que é necessária uma grande quantidade de contaminação para produzir um resultado positivo (depende da concentração).

• Um simples valor ELISA pode não ser capaz de identificar completamente a fase da infecção (é necessário um historial clínico, ver figura 2).
  X = valor ELISA
• Há três pontos diferentes num surto que podem produzir o mesmo valor ELISA, mas a interpretação e as acções a serem tomadas seriam bastante diferentes:
  • Ponto A - Início da infecção - o surto está a começar; podem ser tomadas medidas.
  • Ponto B - Fim da infecção - o surto está a terminar; já não se pode fazer muito.
  • Ponto C - Segundo surto - está a começar um segundo surto. As medidas de biossegurança ou as causas do surto devem ser examinadas.
• Uma segunda amostra dos mesmos animais pode ser necessária após 10 dias - 2 semanas para finalizar a fase (juntamente com a história clínica).
  • Se os resultados do segundo teste forem mais elevados, estamos provavelmente no ponto A.
  • Se os resultados do segundo teste forem muito superiores, estamos provavelmente no ponto C.
  • Se os resultados do segundo teste não mudarem, estamos provavelmente numa fase de planalto.
  • Se os resultados do segundo teste diminuírem, estamos provavelmente no ponto B.
• Valores S:P elevados podem frequentemente estar associados a exposição mais recente
  • Especialmente após uma segunda exposição ou vacinação de reforço (ver Figura 2) (apenas anticorpos ELISA).
  • É importante notar que só porque uma infecção é recente não implica que o agente patogénico ainda esteja presente (ou seja, o animal é viraémico ou bactremico) (apenas anticorpos ELISA).
    • Isto é especialmente verdade para o vírus da Síndrome Reprodutiva e Respiratória do Porco (PRRS).
    • Os porcos podem ser ELISA negativos e ainda ser viremicos.
    • Os porcos podem ter valores elevados de anticorpos no ELISA e ainda não ser viremicos.
    • A PCR é utilizada para estabelecer o nível de viraemia nos animais.
• Valores S:P baixos
  • Uma determinada doença pode não ser estimulante o suficiente para a detecção de anticorpos
  • Mycoplasma hyopneumoniae liga-se principalmente à cílios pulmonares e não estimula a alta produção de IgG sérica.
    Infecção de campo recente produz resultados ELISA mais fortes.
  • As vacinas contra Mycoplasma hyopneumoniae não estimulam uma forte resposta IgG
  • Diferentes testes ELISA detectam vacinas de forma diferente
  • Tipicamente, apenas cerca de 30% dos animais vacinados seroconvertem
  • Os porcos tratados com antibióticos durante várias semanas podem suprimir o crescimento bacteriano durante este período, diminuindo a exposição à doença (mas não eliminando-a), levando a uma resposta imunitária menor ou mais fraca à exposição.
  • Utilização de antibióticos contra Mycoplasma hyopneumoniae precoce ou de transição média
  • Utilizar antibióticos contra agentes patogénicos entéricos, tais como Lawsonia intracellularis precoce ou de transição média.