ELISA como ferramenta de diagnóstico (1/2): Princípios básicos

A utilização de ensaio por imunoabsorção enzimática (ELISA) para a detecção de proteínas (antigénios ou anticorpos) é uma das ferramentas mais prontamente disponíveis em todo o mundo e é actualmente largamente utilizada na produção de suínos. O teste é normalmente utilizado na vigilância e controlo de doenças, bem como uma ferramenta de diagnóstico. Como é frequentemente utilizado pelos veterinários de suínos, é essencial compreender como funciona, o que detecta e as suas vantagens ou desvantagens ao interpretar os resultados. É também importante lembrar que embora a mesma tecnologia seja utilizada contra diferentes agentes patogénicos, os resultados devem ser interpretados de formas diferentes.

Informação do teste

Os testes ELISA são desenhados para a detecção de antigénios ou anticorpos em bactérias ou virus. Os antigénios são proteínas estranhas ao organismo e estimulam a produção de anticorpos (antigénio = gerador de anticorpos). Ao pensarmos em anticorpos, devemos ter em mente que eles são sempre contra as proteínas. Ao conceber o ensaio, o fabricante, ou laboratório, decide quais as proteínas específicas, ou proteínas, que serão visadas. Se o ELISA visa directamente uma proteína situada sobre a bactéria ou vírus, chama-se um ELISA antigénio, enquanto que se o alvo for a resposta de anticorpos do animal à bactéria ou vírus, é conhecido como um ELISA anticorpo. Embora existam ensaios ELISA concebidos para visar apenas uma ou duas proteínas (anticorpos ou antigénios), muitos ELISAs visam um grande número de proteínas. Os ensaios também podem ser concebidos para detectar um tipo específico de resposta de anticorpos (IgG, IgM ou IgA) ou uma combinação destes. Cada um destes tipos de anticorpos tem funções específicas que estão para além do âmbito deste artigo.

O conceito e o processo de detecção de anticorpos ou antigénios por ELISA é exactamente o mesmo. Começa com a obtenção da proteína alvo (antigénio ou anticorpo). Para proteínas individuais, é necessário um processo separado para obter uma concentração purificada desta proteína em particular. Identificar qual a proteína ou proteínas a visar é um processo complexo e científico. Idealmente, o ensaio visa uma única proteína que é única para o agente patogénico de interesse (não se cruza com outros agentes patogénicos), altamente imunogénica (para detecção de anticorpos), ou encontrada em concentrações elevadas (para detecção de antigénios); visa uma proteína que se sabe estar altamente correlacionada com a protecção contra a doença e que estará sempre presente. Infelizmente, a maioria destes critérios são desconhecidos e ou é utilizada uma única proteína, que pode ser produzida e facilmente encontrada na amostra, ou uma mistura de múltiplas proteínas (vírus ou bactérias inteiras). Embora a utilização de vírus ou bactérias inteiras possa ser fácil, é mais provável que estes reajam de forma cruzada com outros agentes patogénicos.

Passos gerais do processo (ver figura 1).

• Passo 1. Pré-revestir os micropoços com o(s) antigénio(s) alvo (para detectar anticorpos) ou anticorpos (para detectar antigénios).
• Passo 2. Adicionar as amostras a serem testadas e incubar para permitir a ligação entre antigénios e anticorpos.
• Passo 3. A amostra é retirada e os anticorpos especiais que se ligarão ao lado oposto dos anticorpos (parte inferior do anticorpo "Y" na detecção de anticorpos) ou antigénios (parte superior do "Y" na detecção de antigénios) são adicionados. A amostra é então incubada para permitir a ligação e lavada para assegurar que anticorpos ou antigénios não ligados (isto é, não alvo) sejam removidos.
• Passo 4. É adicionado anticorpo que é rotulado com um detector que emite fluorescência e se ligará aos anticorpos especiais do passo 3 (ligam-se ao fundo do "Y" do anticorpo, este é o mesmo alvo para a detecção de antigénios e anticorpos). A amostra é então reincubada para permitir a ligação e lavada novamente para assegurar que qualquer anticorpo marcado não ligado seja removido.
  Passo 5. O reagente que irá desencadear a fluorescência dos anticorpos rotulados que se juntaram é adicionado e depois incubado para assegurar a ligação.
• Passo 6. A amostra é lida, geralmente utilizando uma máquina especial calibrada a um comprimento de onda específico para quantificar a mudança de cor (referida como absorvância). Há algumas ligeiras variações neste processo, dependendo de se tratar de um ELISA directo, indirecto ou sandwish cada tipo tem as suas vantagens e desvantagens (que não discutimos aqui) mas, no final, todos produzem os mesmos resultados: quanto maior for a absorção, ou mudança de cor, maior será a concentração esperada do antigénio ou anticorpo alvo na amostra testada.

No caso de um ELISA competitivo, o ponto-chave é que o processo utilizado irá, de facto, produzir o resultado oposto (ver Figura 2B). A amostra e uma quantidade conhecida de antigénio rotulado (para detecção de antigénio) ou anticorpos (para detecção de anticorpos) são adicionados à amostra a ser testada de modo que, uma vez adicionados aos poços marcados, tanto a amostra original como as proteínas marcadas adicionadas (anticorpos ou antigénios) competem para se ligarem ao poço previamente revestido. Em suma, se não houver proteínas alvo na amostra a ser analisada, todas as proteínas marcadas serão capazes de se ligar ao poço, gerando uma forte mudança de cor. Por outro lado, se houver um número considerável de proteínas alvo na amostra, elas irão competir (bloquear) as proteínas marcadas de ligação. Quando a amostra é lavada, todas as proteínas marcadas que não se conseguiam ligar são removidas. Por conseguinte, quanto mais anticorpos ou antigénios existirem na amostra, mais impedirão que as proteínas marcadas se liguem, sendo removidas na lavagem. Isto implica uma baixa absorção quando a concentração da proteína alvo na amostra é elevada, o que é o oposto do caso anterior. Valores altos sugerem uma baixa concentração ou uma amostra negativa e tornam impossível quantificar a concentração de antigénio/anticorpo de amostras positivas.

O ponto de corte para cada teste ELISA pode ser diferente e é pré-definido pelo fabricante com base na sensibilidade e especificidade desejadas. Para ELISAs directos, indirectos ou sandwiches, qualquer número acima do ponto de corte é considerado positivo. Para um ELISA competitivo, qualquer número acima do ponto de corte é considerado negativo. Para alguns testes, é estabelecida uma área cinzenta para classificar as amostras como "suspeitas", uma vez que o teste tende a ter algumas reacções "de fundo" (reacções cruzadas) que dificultam a existência de um ponto de corte claro.

Os resultados são geralmente, mas nem sempre, mostrados como um S:P corrigido ou uma percentagem positiva em relação ao controlo positivo corrigida pela mudança de cor de fundo dos poços de controlo negativo. Os níveis de anticorpos são frequentemente referidos como "títulos". Embora não seja tecnicamente correcto, pode ser justificado numa perspectiva geral. Um ponto chave é que quando se fala de títulos existe uma relação matemática directa entre os valores (um valor de 20 tem o dobro de anticorpos que uma amostra com um valor de 10). Com os valores ELISA, esta relação matemática directa não existe (ver figura 2A). Um ELISA de 2.0 tem significativamente mais anticorpos do que um ELISA de 1.0 e não apenas o dobro.

Pooling de amostras para análise

Como os testes ELISA são dependentes da concentração (correlacionam-se directamente com a concentração da proteína alvo [anticorpo ou antigénio]), a pooling de amostras é fortemente desencorajada. A pooling pode aumentar significativamente a probabilidade de passar uma amostra positiva.

Alguns usos de ELISA:

• Detectar a presença de anticorpos contra agentes patogénicos específicos – ELISA de anticorpos – é o uso mais comum.
• Determinar a exposição a um agente patogénico específico .
• Determinar o estado vacinal de um animal.
• Determinar o momento da infecção (mudança do nível de anticorpos) ao longo do tempo.
• Detectar a presença de um agente patogénico específico através da detecção de proteínas/antigénios do agente patogénico específico– ELISA de antigénios .