PCR como ferramenta de diagnóstico (2/2): Usos e interpretação dos resultados

Alguns usos do teste PCR:

• Detectar a presença de ADN/ARN de um microrganismo patogénico específico - utilização mais comum
• Serotipagem de um microrganismo patogénico para genes específicos (ADN/ARN) conhecido por variar entre serótipos (por exemplo, genes de biossíntese em cápsulas para Actinobacillus pleuropneumoniae)
• Detectar a presença de genes de virulência (por exemplo, genotipagem de E. coli)

É importante lembrar que a PCR apenas detecta a presença de material genético específico dependendo do primer usado e não indica se o microrganismo pode ser infeccioso ou não. Quando os genes são analisados, o teste apenas detecta a presença do gene mas não confirma se o organismo está a expressar o factor de virulência detectado.

Nos últimos anos, os laboratórios desenvolveram PCRs multiplex para analisar vários microrganismos patogénicos ou várias estirpes ou genes do mesmo microrganismo patogénico ao mesmo tempo. Estes PCRs multiplex são múltiplos PCRs executados ao mesmo tempo. O seu custo é maior que uma PCR individual mas muito inferior à realização de várias PCRs separadamente, uma vez que os laboratórios têm economias consideráveis em termos de equipamento, pessoal de laboratório e reagentes. O laboratório utilizará diferentes marcadores para identificar que resultados positivos correspondem a que primer. Muitas vezes estes PCRs multiplex são muito úteis, tal como na genotipagem de E. coli, onde cerca de 14 genes podem ser analisados no mesmo isolado bacteriano, ao mesmo tempo. Outros exemplos são a análise simultânea para PRRS tipo 1 e tipo 2 ou para a diarreia epidémica suína e o delta coronavírus suíno. É essencial ter em mente que o desenvolvimento destes testes nem sempre é fácil, pois o laboratório deve assegurar que não há interferência entre os diferentes PCR. Isto significa que as temperaturas de ciclo e os diferentes primers utilizados não se inibem nem se cruzam entre si. Cada um destes PCR multiplex deve ser validado antes de ser utilizado e produzir uma optimização significativa do teste.

Considerações na interpretação dos resultados:

Um dos maiores desafios da PCR é que cada laboratório tem frequentemente um protocolo diferente para a análise de amostras, o que pode levar a diferenças no processo de extracção de ADN/ARN, nos protocolos de ciclos, bem como nos primers utilizados. Isto pode tornar difícil a comparação dos resultados obtidos em diferentes laboratórios.

Resultado negativo

• Amostra/exploração verdadeiramente negativa para o agente patogénico.

• Assegurar o envio de amostras apropriadas para o agente patogénico em questão. Alguns exemplos típicos a considerar:

  • O vírus da gripe não se torna sistémico, pelo que não será encontrado em amostras de sangue.

  • Os testes de Mycoplasma hyopneumoniae em amostras de fluido oral raramente fornecem um resultado positivo, uma vez que o agente patogénico se liga normalmente a cílios no sistema respiratório inferior.

  • A submissão de apenas um feto de aborto PRRS dá apenas 50% de hipóteses de ser positivo, devem ser enviados pelo menos 4 fetos para maximizar a hipótese de encontrar uma amostra positiva.

• Amostra recolhida demasiado tarde no desenvolvimento da doença pelo que o agente patogénico já não está presente.

  • Vírus da gripe encontrado nas secreções nasais apenas durante os primeiros 3-4 dias

• Incompatibilidade de primers

  • Nova estirpe de PRRS

• Baixa prevalência em animais de exploração e não infectados

  • Necessidade de aumentar significativamente o número de animais amostrados

• Diluição de uma amostra positiva fraca devido ao agrupamento de amostras

  • Polling de fluidos orais que normalmente já são amostras diluídas (testando vários porcos e valores elevados de Ct já esperados em amostras positivas)

Resultado positivo

• Amostra/exploração verdadeiramente positiva para o agente patogénico

• Não distingue se a amostra é infecciosa ou não-infecciosa.

• Dependendo do agente patogénico, a detecção de ADN/ARN nem sempre confirma a doença

  • O tecido pulmonar PCR positivo para Mycoplasma hyopneumoniae confirma a presença do organismo no tecido mas não a gravidade ou o significado clínico do agente patogénico. Na maioria das explorações (excepto explorações negativas ao Mycoplasma), a confirmação visual da percentagem de danos pulmonares (avaliação macroscópica) é necessária para determinar o significado clínico dos resultados.

  • A PCR sérica positiva para o vírus de circulação suíno tipo 2 (PCV2) confirma a presença do PCV2 mas não se a decomposição ou pneumonia é atribuível ao PCV2 ou se ocorreu uma falha de vacina. A imunohistopatologia do tecido pulmonar e/ou linfóide é necessária para demonstrar a doença associada ao PCV2.

  • O teste não faz distinção entre vírus/bactérias de vacinas vivas modificadas e infecção de campo.

    • É importante saber o momento e o tipo de vacina utilizada.

    • Poderá ser necessária informação de sequenciação.

• Pode haver contaminação cruzada se as amostras não forem tratadas correctamente.

  • Especialmente quando se trata do pooling de amostras. O pooling deve ser feito sob protecção.
  • As amostras fecais recolhidas no solo podem estar contaminadas com vestígios ambientais do agente patogénico.
• Valores baixos de Ct estão associados a uma alta concentração de vírus/bactérias na amostra e podem frequentemente ser correlacionados com uma maior probabilidade de doença clínica.
  • Baixos valores de Ct de Lawsonia intracellularis nas fezes estão possivelmente mais estreitamente relacionados com lesões intestinais
    • Ct < 20 → Enteropatia proliferativa dos suínos
    • Ct > 30 → Não foram detectadas lesões intestinais

Genotipagem

• O uso da genotipagem por PCR tornou-se mais comum especialmente para a E. coli. Fornece informação epidemiológica sobre alterações nas estirpes que afectam a exploração (por exemplo, gripe H1N1 vs H3N2).
• Muitas vezes são utilizados resultados de genotipagem para seleccionar a vacina a ser utilizada, como no caso da E. coli (confirmação de pili).
• É importante lembrar que os resultados representam apenas uma única estirpe e frequentemente os porcos são infectados com várias estirpes ao mesmo tempo.
• A detecção apenas confirma a presença de genes de virulência, mas não a sua expressão. Muitas vezes é suficiente saber que tem o potencial genético para expressar o gene.
• Como o custo e a facilidade da sequenciação de genes continua a diminuir, a utilização ou necessidade de genotipagem por PCR diminuirá.