Diagnóstico laboratorial: síndrome reprodutivo e respiratório suíno (PRRS)

Alejandro Ramirez
14-Abr-2021 (há 4 anos 11 meses 24 dias)

Ensaios disponíveis

Reacção em cadeia da polimerase (PCR)

Detecta a presença de sequências específicas de ácido nucleico viral (ARN).
Tipos de amostras: tecidos, sangue, soro, fluídos orais, etc.
Prós:
- são usados primers independentes para detectar PRRS tipo 1 (europeu) e tipo 2 (norte americano) simultaneamente na mesma amostra;
- sensibilidade muito alta (pode detectar pequenas quantidades de vírus);
- detecção precoce: os casos agudos têm que ser positivos;
- podem ser usados muitos tipos diferentes de amostras (tecido, sangue, soro, fluídos orais, etc).
- custo moderado:
  - podem ser combinadas 5 amostras de soro ou tecido para reduzir o custo e minimizar a perda de sensibilidade;
  - não é habitual fazer pools de amostras de fluídos orais devido a que o valor Ct (número de ciclos necessários para amplificar o RNA viral até alcançar um nível detectável) será más alto (porque as concentrações de vírus são mais baixas), o que pode comportar uma perda significativa de sensibilidade.
Contras:
- o laboratório tem que actualizar os primers periodicamente para evitar falsos negativos:
  - devem ser actualizados tanto os primers para o PRRS tipo 1 como para o tipo 2;
- faz falta sequenciação para diferenciar o vírus vacinal da infecção pelo vírus de campo.

Ensaio por imunoabsorção ligado a enzimas (ELISA)

Detecta a presença de anticorpos.
Tipos de amostras: soro ou fluídos orais (alguns kits).
Prós:
- a maioria detecta anticorpos de ambos os tipos de PRRS;
- os animais permanecem positivos durante vários meses (3-12 meses);
- pode ser utilizado em casos crónicos;
Contras:
- os anticorpos específicos e o momento da detecção podem variar ligeiramente entre os diferentes kits comerciais disponíveis;
- os animais demoram entre 7 e 10 dias em tornar-se seropositivos;
- não se diferencia entre anticorpos maternais e os de exposição;
- não se distingue entre vacinação e infecção por vírus campo.

Imunohistoquímica (IHC)

Detecta a presença de antigénios virais.
Tipos de amostra: tecidos.
Prós:
- detecta o vírus no sítio da lesão (boa prova de causalidade);
- permite diferenciar entre quantidades baixas, moderadas e altas de vírus presentes;
Contras:
- tem que ser enviada a amostra de tecido correcta;
- necessita uma quantidade de vírus significativamente maior que a PCR;
- avalia apenas uma pequena quantidade de tecido.

Sequenciação genética

Sequencia os ácidos nucleicos genéticos do vírus (ARN).
Tipo de amostras: tecidos, sangue, soro, fluídos orais, etc.
Prós:
- permite diferenciar entre vírus de campo e as vacinas;
- pode ajudar a diferenciar a introdução de novos vírus relativamente aos existentes ou os do passado.
Contras:
- caro;
- frequentemente, apenas é sequenciada a ORF5, que representa 600 pares de bases de uns ~15.000;
- as amostras com valores CT elevados (> 34) tendem a ser mais difíceis de sequenciar.

Tabela 1: Êxito das sequenciações da Iowa State University Veterinary Diagnostic Laboratory segundo os valores do limíte de ciclo de PCR para PRRS (Ct) em amostras de fluídos orais. Chris Rademacher et al. 2016.

Amostra	Intervalo de Ct da PCR	Total de amostras analisadas	Número de amostras sequenciadas	% amostras positivas sequenciadas
Todas as amostras	<30	2016	2013	99,85
	30,00-31,99	389	361	92,80
	32,00-33,99	324	265	81,79
	34,00-35,99	185	109	58,92
	36,00-37,00	65	26	40,00

Anticorpos fluorescentes indirectos (IFA)

Detecta a presença de anticorpos.
Tipos de amostras: soro.
Prós:
- junto com a PCR, pode servir para confirmar uma amostra inesperadamente positiva a ELISA.
Contras:
- não é possível para números grandes de amostras;
- os resultados dependem do isolado vírico usado no ensaio;
- a fiabilidade depende muito da habilidade dos técnicos.

Interpretação de resultados

PCR

Positivo – O vírus está presente/a circular, o que é muito sugestivo de causalidade, especialmente nos valores de Ct mais baixos e presença de sinais clínicos. A vacinação recente com um vírus vivo modificado pode dar lugar a PCR positivas.
Negativo – Negativo ou o vírus não é detectado se o teste é realizado muito depois da infecção.

ELISA

Positivo – Anticorpos maternais ou exposição anterior (normalmente > 7-10 dias) a vacina ou vírus campo.
Negativo – Negativo ou infecção demasiado recente para ser detectada (normalmente deve ser, pelo menos, 7-10 dias pós-exposição).

IHC

Positivo – O vírus está presente no sítio da lesão.
Negativo – Negativo ou infecção demasiado antiga para detectar vírus.

Sequenciação genética

Virus vacinal – espera-se uma homologia > 99%
Virus de campo – estima-se uma perda de homologia de 1-2% anual.

IFA

Positivo – Anticorpos maternais ou exposição anterior (> 7-10 dias) a vacina ou vírus de campo.
Negativo – Negativo ou infecção demasiado precoce para poder ser detectada (deve ser, pelo menos, 7-10 pós-exposição).

Cenários

Abortos de porcas/primíparas

Fetos abortados: recolha de 6-8 fetos para fazer pool das amostras para PCR. Apenas cerca de 50% dos fetos serão PCR positivos (pelo que é necessário amostrar muitos fetos), mas os positivos terão uma elevada concentração vírica pelo que podem ser feitas pooles de 10 amostras para a PCR.
Porcas/primíparas abortadas: recolha de soro de porcas/primíparas abortadas recentemente (< 10 dias) para PCR. Podem ser misturadas em grupos de 5. Os testes ELISA não são úteis já que as porcas/primíparas não expostas demorarão cerca de 7-9 dias para ser positivas.

Problemas reprodutivos em porcas/primíparas

Recolha de 15 a 20 amostras de fêmeas afectadas e 15 a 20 das não afectadas (30 – 40 amostras no total) e analisá-las por PCR (pooles de 5 ou 6) e ELISA (individualmente).

Leitões nascidos fracos

Podem ser recolhidos fluídos orais familiares de várias ninhadas com leitões fracos e analisá-los por PCR.
Podem ser recolhidos testículos (se castrados), caudas, línguas (de animais mortos) de leitões de diferentes ninhadas na sala de maternidade. Podem ser feitas pooles de muitas amostras para análise.
Recolha de amostras de soro de 10 ninhadas afectadas (2 ou 3 leitões por ninhada) e ser analisadas por PCR em pools de 5 ou 6. Os leitões não podem ter sido vacinados contra PRRS.

Porcos de engorda com sinais clínicos agudos de PRRS

Recolha de fluidos orais de 4 a 6 parques diferentes e analisar individualmente através de PCR. Não fazer pools com as amostras.
Recolha de amostras de soro de 15 a 30 porcos com sinais clínicos ou fazer uma amostragem aleatória e analisar por PCR. Podem ser feitas pools em grupos de 5 ou 6.

Porcos de engorda com sinais clínicos crónicos de PRRS

Recolha de fluídos orais de 4 a 6 parques diferentes e analisar individualmente através de PCR. Não fazer pools das amostras.
Recolha de 30 amostras séricas de porcos com sinais clínicos ou fazer uma amostragem aleatória e analisar através de PCR. Podem ser misturadas em grupos de 5 ou 6. Também podem ser analisadas amostras individuais por ELISA para confirmar a exposição.