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Retos en el diagnóstico de PRRSV

Actualmente, no puede recomendarse ningún análisis RT-PCR como método universal que permita la detección de todas las cepas de PRRSV con una sensibilidad óptima.

Los signos clínicos de la infección por el virus PRRS (PRRSV) pueden ser diversos, por lo que deben ser confirmados mediante análisis laboratoriales. Los más frecuentes son ELISA y RT-PCR, que detectan anticuerpos específicos para PRRSV o ácido nucleico viral, respectivamente.

La elección del método diagnóstico más adecuado depende del objetivo diagnóstico. Para monitorizar granjas negativas se prefieren métodos muy específicos, mientras que para analizar semen de verracos individuales se requieren métodos de máxima sensibilidad y que detecten la infección en la fase lo más temprana posible. Al planear y ejecutar un programa de control de  PRRS, lo mejor es optar por una combinación de ELISA y PCR seguidos por la secuenciación de DNA. El protocolo de muestreo en una granja concreta debe planificarse ex profeso, dependiendo del objetivo diagnóstico y de la organización de la granja. La pregunta más sencilla, si una granja está o no infectada por PRRSV, puede responderse con un test ELISA a 10-20 cerdos de engorde. Un análisis detallado de la circulación de PRRSV en una explotación de ciclo cerrado o en una multisitio, requiere el análisis de un gran número de muestras que representen varios grupos de edad y todos los sitios, ya que pueden representar ecosistemas virales independientes.

La interpretación de la seroconversión o de la detección del virus en granjas donde se utilizan vacunas vivas modificadas representa un reto ya que (1) no hay vacunas marcadas en el mercado, (2) los virus vacunales pueden persistir en las granjas vacunadas y (3) al menos durante un tiempo pueden coexistir con las cepas salvajes del virus. En dichas granjas se requiere la secuenciación de amplicones de ADN obtenidos en distintos grupos de edad para entender totalmente la circulación del virus.

ELISA

El análisis serológico mediante ELISA es fácil de llevar a cabo y suele tener una buena especificidad y sensibilidad cuando se aplica a toda la granja. Si embargo el suero de animales individuales, especialmente de cerdos adultos, puede producir falsos positivos. Esto constituye un problema en la monitorización de poblaciones negativas y requiere la repetición del análisis de las muestras con un método distinto (p.e.: IPMA, IFA u otro test ELISA de mayor especificidad), o una nueva toma de muestras tras 2–3 semanas. Esta parte del rendimiento de los tests ELISA raramente se tiene en cuenta cuando se evalúan las competencias diagnósticas. La baja sensibilidad de un test ELISA concreto se puede compensar aumentando el número de muestras analizadas, mientras que la baja especificidad siempre requiere la aplicación de herramientas adicionales.

Generalmente, cualquier test ELISA es útil para la detección de anticuerpos frente a cualquier genotipo de PRRSV, pero los kits que sólo utilizan antígenos de un genotipo suelen ser menos sensibles frente al otro genotipo. También hay kits para discriminar la seroconversión frente a los dos genotipos pero, debido a la reacción serológica cruzada entre ambos, los resultados deben interpretarse con cuidado. Siempre es recomendable la discriminación con PCR para confirmar el diagnóstico de la coinfección de una granja con ambos genotipos.

Los métodos PCR detectan ácidos nucleicos virales basándose en la unión complementaria de  oligonucleótidos sintéticos cortos (primers) a un fragmento concreto del genoma viral, que es amplificado posteriormente mediante una reacción enzimática. En la mayoría de métodos PCR a tiempo real el producto de la reacción se detecta mediante la monitorización de la señal emitida por la sonda DNA tras unirse a la secuencia específica. Debido a la naturaleza de esta reacción esta señal también puede ser emitida en ausencia de la secuencia viral, especialmente en los últimos ciclos de la PCR, lo que puede parecer un positivo débil.

ELISA

ELISA

Ellingson 2013, thesis, Iowa SU

Sin embargo, la mayor preocupación respecto a los métodos RT-PCR está relacionada con la elevada diversidad genética del virus lo que puede dar lugar a la acumulación de mutaciones en nucleótidos dentro de los fragmentos de genoma en los que se unen los primers y las sondas por lo que pueden dar falsos negativos de la PCR. Un análisis comparativo de kits RT-PCR comerciales llevado a cabo por un laboratorio de referencia de la OIE (Podgorska et al., 2015) indicaron que algunos de los kits fallaron ante muchas cepas tipo 1 del PRRSV originarias mayoritariamente del este de Europa. Debido a la limitada disponibilidad de secuencias de Europa del este, la mayoría de primers y sondas utilizadas en los métodos actuales se desarrollaron en base a  las clásicas cepas de tipo 2 y tipo 1 subtipo 1, mientras que las cepas de Europa del este de los subtipos 2-4 son genéticamente muy divergentes (Stadejek et al. 2013). Además, algunas de ellas han demostrado ser más virulentas que las cepas circulantes en el oeste y centro de Europa, por lo que se les debería prestar una atención especial para asegurar una detección precoz en caso de propagarse.

 

Lotes de amplificación

Actualmente, no puede recomendarse ningún análisis RT-PCR como método universal que permita la detección de todas las cepas de PRRSV con una sensibilidad óptima. Estas observaciones ponen de relieve la necesidad de una evaluación exhaustiva de los métodos utilizados en la actualidad y su validación constante en función de las cepas circulantes en cada momento. Para ello debe crearse una colección de cepas de PRRSV que abarquen la diversidad genética conocida del virus, lo que en este momento es uno de los objetivos más importantes de los laboratorios de referencia de PRRS.

PRRS

Patología pulmonar de PRRSV20-oct-2015 hace 1 años 1 meses 13 días

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