Diagnostyka laboratoryjna: Wirus grypy typu A (IAV)

Dostępne testy:

Warto zapoznać się ze świetnym podsumowaniem zawartym w artykule Phila Gaugera na temat grypy:

Ocena zmian makroskopowych:

• Ocenia obecność zmian w tkankach, które mogą sugerować obecność choroby.
• Lokalizacja zmian:
  • Konsolidacja dogłowowo-brzuszna (zwłaszcza płat szczytowy i sercowy)

• Objawy mogą być rozproszone, obejmując wiele obszarów płuc

• Może występować obrzęk międzypłatowy

• Zalety:
  • Nasilenie zmian może mieć związek ze znaczeniem klinicznym
• Wady:

  • Zmiany makroskopowe nie są diagnostyczne (bardzo podobne do towarzyszących zakażeniu Mycoplasma hyopneumoniae)

  • Często występują wtórne lub współistniejące infekcje

Histopatologia

• Ocenia obecność zmian, które mogą potwierdzić obecność choroby.

• Rodzaje próbek: tkanka płucna

• Zalety:
  • Martwicze zapalenie oskrzelików jest zwykle uważane za patognomoniczne dla zakażenia wirusem grypy typu A u świń
  • Charakterystyczne zmiany pojawiają się kilka dni po wyeliminowaniu wirusa z organizmu świni, zwłaszcza w przypadku współwystępowania zakażeń.
• Wady:
  • Ocena tylko małej próbki tkanki
  • Niepowikłane zmiany mogą szybko ustąpić (5-7 dni)

Immunohistochemia (IHC)

• Wykrywa obecność antygenu wirusowego

• Typy próbek: tkanka płucna

• Zalety:
  • Wykrywa wirusa w miejscu uszkodzenia (dobry dowód na związek przyczynowy)
  • Docelowym antygenem jest często nukleoproteina wirusa grypy typu A, która nie ma tendencji do dużej zmienności.
• Wady:
  • Ocena tylko małej próbki tkanki
  • Wirus jest obecny tylko przez krótki okres czasu (kilka dni)
  • Wymaga obecności znacznie większej ilości wirusa niż PCR

Izolacja wirusa

• Izoluje żywego wirusa
• Rodzaje próbek: tkanka płucna, popłuczyny oskrzelowo-pęcherzykowe, wymazy z nosa
• Zalety:
  • Tradycyjny złoty standard
  • Izolacja wirusa do wykorzystania w opracowywaniu szczepionek (szczepionki autogenne) lub testach serologicznych (hamowanie hemaglutynacji) w celu określenia ochrony krzyżowej.
• Wady:
  • Drogie
  • Długie oczekiwanie na wynik
  • Wymaga zarodków kurzych jaj lub komórek Madin-Darby canine kidney (MDCK)
  • Proces inokulacji jest bardzo pracochłonny
  • Często trudny do wyhodowania (wiele wyników fałszywie ujemnych)
  • Sposób pobierania próbek z terenu do laboratorium może wpływać na przetrwanie wirusa

Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR)

• Wykrywa obecność określonej sekwencji wirusowego kwasu nukleinowego (RNA)
• Rodzaje próbek: wymazy z nosa, płyny ustne, tkanka płucna, popłuczyny oskrzelowo-pęcherzykowe
• Zalety:
  • Startery mogą być zaprojektowane do:

    • Wykrywania wszystkich podtypów wirusa grypy A - docelowa mało zmienna nukleoproteina

    • Wykrywanie określonych grup podtypów wirusa: podtyp H1, H3, N1 lub N2

  • Wysoka czułość
  • Wczesne wykrywanie
  • Kwantyfikacja PCR może być powiązana z obecnością zmian chorobowych
  • Umiarkowany koszt
• Często można łączyć wymazy lub próbki tkanek, aby obniżyć koszty, jednocześnie minimalizując utratę czułości (szczególnie w odniesieniu do znaczenia klinicznego).
• Wady:
  • Wysoka czułość - szczególnie w płynach ustnych może wykryć obecność niewielkich ilości wirusa w stadzie, co sprawia, że kliniczna interpretacja wyników jest trudna w odniesieniu do zakresu lub ciężkości choroby.
  • Wirus jest obecny w organizmie gospodarza tylko przez kilka dni (3-5 dni, zwłaszcza w wymazach z nosa).
  • Nie można użyć próbek krwi lub surowicy do testów PCR, ponieważ wirus pozostaje w drogach oddechowych i nie ma charakteru ogólnoustrojowego.

Sekwencjonowanie genomu

• Sekwencjonuje segmenty genetycznego kwasu nukleinowego (RNA) wirusa
• Rodzaje próbek: tkanki płuc, wymazy z nosa, popłuczyny oskrzelowo-pęcherzykowe, płyny ustne
• Zalety:
  • Można różnicować podtypy na wiele różnych poziomów kladów.
    • H1: dalej podzielony na klady zwykle nazywane przy użyciu alfabetu greckiego (alfa, beta, gamma itp.)
    • H3: dalej podzielony na gromady zwykle nazywane przy użyciu cyfr rzymskich (I, IV, itd.).
    • Wiele z tych odpowiednich kladów lub klastrów zostało opisanych tutaj.
• Może pomóc w odróżnieniu nowo wprowadzonego wirusa od istniejących lub przeszłych wirusów.
• Może pomóc w wyborze szczepu szczepionki w oparciu o podtyp/klad
• Wady:
  • Kosztowne
  • Zazwyczaj tylko sekwencja genu HA
  • Zmienność między podtypami/kladami nadal rośnie i staje się bardzo złożona.

Test immunoenzymatyczny (ELISA)

• Wykrywa obecność przeciwciał
• Rodzaje próbek: surowica
• Zalety:
  • ELISA może być zaprojektowana tak, aby:
    • Wykrywać przeciwciała różnych podtypów - ukierunkowane na konserwatywną nukleoproteinę
    • Wykrywać przeciwciała specyficzne dla podtypu - docelowe specyficzne białka hemaglutyniny (określane jako H lub HA) i/lub neuraminidazy (określane jako N lub NA)
• Zwierzęta pozostają dodatnie przez kilka tygodni (wynik zaczyna spadać po 8-10 tygodniach)
• Może być stosowana w przypadkach przewlekłych
• Wady:
  • Wykrywane specyficzne przeciwciała i czas wykrycia różnią się nieznacznie w zależności od dostępnych zestawów komercyjnych.
  • Serododatniość trwa od 10 do 14 dni.
  • Nie można odróżnić przeciwciał poszczepiennych od tych po zakażeniu wirusem typu dzikiego
  • Nie można zidentyfikować konkretnego podtypu wirusa

Hamowanie hemaglutynacji (HI)

• Wykrywa obecność przeciwciał
• Rodzaje próbek: surowica
• Zalety:
  • Zwierzęta pozostają dodatnie przez kilka tygodni
  • Może być stosowany w przypadkach przewlekłych
  • Może być stosowany w celu lepszego określenia właściwego czasu szczepienia poprzez uniknięcie interferencji przeciwciał matczynych
  • Może być stosowany do określenia ochrony krzyżowej między izolatami
• Wady:
  • Każdy test jest swoisty dla danego szczepu
  • Wymaga izolacji określonego szczepu w celu przetestowania ochrony krzyżowej
  • Serododatniość trwa od 10 do 14 dni.
  • Nie można odróżnić zakażenia szczepionką od zakażenia szczepem dzikim

Interpretacja wyników

Zmiany makroskopowe

• Dodatni: Potwierdzenie obecności zapalenia płuc
• Ujemny: Wczesne przypadki mogą nie objawiać się rozległymi zmianami w płucach

Histopatologia

• Dodatni: Potwierdzenie choroby
• Ujemny: Wynik ujemny lub zmiany mogły zostać przeoczone w przypadku badania niewłaściwej próbki lub zbyt późno po zakażeniu.

IHC

• Dodatni: Wirus jest obecny w miejscu zmiany
• Ujemny: Ujemny lub wirus mógł zostać przeoczony, jeśli testowanie nastąpiło zbyt późno po zakażeniu lub stężenie wirusa jest zbyt niskie (obecne tylko przez bardzo krótki okres czasu).

Izolacja wirusa

• Dodatni: Potwierdzenie choroby
• Ujemny: Ujemny, wirus mógł zostać przeoczony, jeśli testowanie nastąpiło zbyt późno po zakażeniu lub po prostu nie był w stanie się namnażać z powodu innego zanieczyszczenia lub złego obchodzenia się z próbką (obecny, ale może być trudny do wyhodowania).

PCR

• Dodatni: Potwierdzenie choroby
• Ujemny: Ujemny, wirus mógł zostać przeoczony, jeśli test został przeprowadzony zbyt późno po zakażeniu lub w przypadku niewłaściwego doboru próbki lub obchodzenia się z nią.
• Wątpliwy: Zbyt mała ilość wirusa lub koinfekcja z więcej niż jednym podtypem

Sekwencjonowanie genomu

• Umożliwia identyfikację podtypu i kladu wirusa
• Umożliwia dopasowanie izolatu szczepionki dla lepszej ochrony

ELISA

• Dodatni: Przeciwciała matczyne lub wcześniejsza ekspozycja (> 2 tygodnie) na szczepionkę lub wirus typu dzikiego
• Ujemny:
  • Ujemny wobec szczepionki lub wirusa typu dzikiego
  • Infekcja zbyt wczesna do wykrycia (10-14 dni do serokonwersji)
  • Niedopasowanie między testem a wirusem (podtyp lub klad)

HI

• Dodatni: Przeciwciała matczyne lub wcześniejsza ekspozycja (> 2 tygodnie) na szczepionkę lub wirus typu dzikiego
• Ujemny:
  • Ujemny wobec szczepionki lub wirusa typu dzikiego
  • Infekcja zbyt wczesna do wykrycia (10-14 dni do serokonwersji)
  • Niedopasowanie między testem a wirusem (podtyp lub klad)

Możliwe scenariusze

Rosnące świnie, które kichają i wykazują ze strony układu oddechowego (ostre lub przewlekłe):

• Pobrać 2-4 próbki płynu ustnego od grupy i przetestować metodą PCR.
• Pobrać 12 wymazów z nosa od zakażonych świń z objawami klinicznymi (z wyraźną wydzieliną z nosa) i wykonać 3 pule po 4 próbki testowane metodą PCR.
• Sekwencjonowanie jednej dodatniej próbki PCR w celu lepszego określenia klastra/kladu

Określenie czasu narażenia i ewentualnej potrzeby szczepienia:

• Pobranie próbek od 10-15 świń w wieku 3, 6, 9 i 12 tygodni.
• Dwa podejścia do pobierania próbek:
  • Przekrojowe - pobieranie próbek od różnych grup wiekowych w tym samym czasie (szybsze uzyskanie wyników).
  • Podłużne - zbieranie od tych samych świń w czasie (wyniki są dokładniejsze).
• Badanie próbek surowicy za pomocą testu ELISA.
• Pobranie 2-4 próbek płynu ustnego z grupy i zbadanie ich metodą PCR.
• Sekwencjonowanie jednej dodatniej próbki PCR z każdej grupy wiekowej w celu lepszego określenia klastra/kladu