ELISA jako narzędzie diagnostyczne (2/2): interpretacja wyników

Uwagi dotyczące interpretacji wyników:

• Potrzeba czasu, aby świnie wystawione na działanie patogenu (dzikiego typu lub szczepionkowego) wytworzyły wystarczającą ilość przeciwciał do wykrycia za pomocą ELISA (zwykle co najmniej 2-4 tygodnie po ekspozycji w zależności od patogenu i docelowego przeciwciała).
• ELISA na obecność przeciwciał nie jest w stanie odróżnić przeciwciał matczynych (przeciwciał biernych) od przeciwciał powstałych w wyniku ekspozycji (przeciwciał czynnych).
• ELISA na obecność przeciwciał często nie mogą odróżnić przeciwciał indukowanych szczepionką od przeciwciał indukowanych ekspozycją na patogen typu dzikiego.
• W niewielu przypadkach można opracować specjalne ELISA w celu odróżnienia zwierząt zakażonych od szczepionych (szczepionki DIVA).
• Wyniki ELISA wykazujące obecność przeciwciał nie oznaczają ochrony. Ochrona może pochodzić od innych przeciwciał, które mogą być niemierzalne przez test lub przez odporność komórkową, która jest zupełnie inna niż odporność humoralna lub odporność ze strony przeciwciał, które nie są badane danym ELISA.
• ELISA na obecność antygenu jest znacznie mniej czuła (niska czułość analityczna) w wykrywaniu antygenu w porównaniu do testu PCR wykrywającego materiał genetyczny. Test PCR aktywnie powiela obecne w próbce DNA/RNA i dlatego może wykryć bardzo niskie poziomy wirusów lub bakterii. Z drugiej strony, antygen ELISA wymaga znacznie większego stężenia wirusa lub bakterii, aby indukować wystarczającą zmianę koloru, która może być wykryta.
• Wyniki są standaryzowane i powszechnie spójne w różnych laboratoriach, gdy używane są komercyjne zestawy ELISA (powszechnie dostępne i używane). ELISA wewnętrzne (tzw. in-house) wykonywane w laboratoriach mogą dawać duże zróżnicowanie wyników, chyba że praktyka produkcyjna jest wysoce ustandaryzowana i przestrzegana.
• Nie wszystkie patogeny wywołują mierzalną odpowiedź immunologiczną
• Każdy zestaw ELISA będzie zazwyczaj badał różne białka, co może dawać bardzo różne wyniki dla tej samej próbki. Znamiennym przykładem jest wiele różnic w dostępnych zestawach ELISA dla przeciwciał Mycoplasma hyopnemoniae; zdecydowanie nie wszystkie zestawy są jednakowe.
• Dawka i/lub droga narażenia mogą mieć wpływ na poziom odpowiedzi immunologicznej (poziom produkcji przeciwciał).
• Ważne jest, aby znać czułość testu (zdolność do wykrywania wyników prawdziwie dodatnich) i swoistość (zdolność do identyfikowania wyników prawdziwie ujemnych jako ujemnych; brak reakcji krzyżowych).
• Mogą wystąpić fałszywie dodatnie i fałszywie ujemne wyniki, ponieważ ilość ekspozycji i odpowiedź immunologiczna na patogeny różnią się między poszczególnymi świniami (rozkład normalny) i często istnieje pewne tło lub reaktywność krzyżowa, która nie może być całkowicie wyeliminowana (patrz ryc. 1).
• Przeciwciała zwykle pozostają obecne/mierzalne przez kilka miesięcy po ekspozycji/szczepieniu.

Wynik ujemny

• Próbka/ stado prawdziwie ujemne na obecność patogenu (brak ekspozycji i brak szczepienia)
• Próbka/ stado prawdziwie ujemne dla patogenu, chociaż zwierzęta mogą być szczepione (jeżeli badanie ma opcję DIVA) (dotyczy ELISA na obecność przeciwciał)
• Zbyt mała ilość antygenu w próbce do wykrycia (dotyczy ELISA na obecność antygenu)
• Próbka pobrana zbyt wcześnie w trakcie infekcji i świnia nie była w stanie wytworzyć wykrywalnej odpowiedzi immunologicznej (dotyczy ELISA na obecność przeciwciał)
  • PRRS często wymaga 7-10 dni do wystąpienia serokonwersji
  • Lawsonia intracellularis często wymaga 4-6 tygodni do wystąpienia serokonwersji w zależności od dawki narażenia.
• Próbka pobrana zbyt późno w trakcie choroby, a patogen nie jest już obecny.
  • Wirus grypy obecny w wydzielinach z nosa tylko przez pierwsze 3-4 dni
• Niedopasowanie docelowych przeciwciał/antygenów
  • Różne szczepy grypy (różnice między H₁N₁ a H₃N₃, a także różnice między różnymi kladami H₁N₁)
• Niska częstość występowania w stadzie, a zwierzęta, od których pobrano próbki, nie były zakażone
  • Potrzeba zwiększenia liczby zwierząt, od których pobiera się próbki
• Dana choroba może nie stymulować wystarczającej ilości przeciwciał do wykrycia.
  • Mycoplasma hyopneumoniae przyczepia się głównie do rzęsek w płucach i nie stymuluje wysokiej produkcji IgG w surowicy.
    • Ostatnie zakażenie terenowe daje znacznie silniejsze wyniki ELISA
  • Szczepionki przeciwko Mycoplasma hyopneumoniae nie stymulują silnej odpowiedzi immunologicznej IgG
    • Różne ELISA różnie wykrywają fakt szczepienia
    • Zazwyczaj tylko około 30% zaszczepionych zwierząt ulega serokonwersji
• Rozcieńczenie słabo dodatniej próbki w wyniku łączenia próbek
  • Zdecydowanie odradzamy łączenie próbek!

Próbka dodatnia

• Próbka/ stado rzeczywiście dodatnie pod względem narażenia na patogen
• Nie można odróżnić, czy próbka jest zakaźna czy niezakaźna
• Nie można odróżnić przeciwciał matczynych od naturalnego narażenia lub szczepienia
  • Większość przeciwciał matczynych znika do 8-12 tygodnia życia.
  • W miarę jak świnie dorośleją, wartości ELISA powinny znacząco spadać w czasie
  • Można badać świnie w czasie, aby potwierdzić zanik przeciwciał matczynych, jak również brak ekspozycji w terenie (brak nowych infekcji)
• W zależności od docelowego patogenu, wykrycie białka (antygen/przeciwciało) nie zawsze potwierdza chorobę
  • Surowica, w której wykryto przeciwciała w ELISA dla cirkowirusa świń typu 2 (PCV2), potwierdza narażenie na PCV2 zarówno zwierząt szczepionych, jak i zakażonych (oba przypadki są dość powszechne), ale nie potwierdza, czy wyniszczenie lub chorobę można przypisać PCV2, czy też doszło do błędów dotyczących szczepionki. Konieczne jest wykonanie badania immunohistopatologicznego płuc i tkanki chłonnej w celu wykazania choroby związanej z PCV2
  • Test może nie być w stanie odróżnić narażenia na wirus/bakterie szczepionkowe ze zmodyfikowanej żywej szczepionki od zakażenia typu dzikiego (dotyczy ELISA na obecność przeciwciał).
    • Stosuje się zarówno do szczepionek zabitych jak i żywych modyfikowanych.
    • Przydatna jest wiedza na temat czasu użycia szczepionki, chociaż nie jest ona krytyczna, ponieważ zwierzęta mogą pozostać dodatnie dla niektórych chorób przez długi okres czasu (wiele miesięcy)
• Zakażenie krzyżowe jest mało prawdopodobne, ponieważ do uzyskania dodatniego wyniku potrzebna jest duża ilość zakażenia (zależna od stężenia)

• Pojedyncza wartość ELISA może nie określać w pełni stadium zakażenia (potrzebny jest wywiad kliniczny)
  • Patrz ryc. 2
  • X = wartość ELISA
  • Trzy różne punkty ogniska choroby mogą dawać taką samą wartość ELISA, ale interpretacja i potrzebne działania będą zupełnie inne:
    • Punkt A - wczesne stadium zakażenia - ognisko rozpoczyna się; można podjąć działania
    • Punkt B - późne stadium zakażenia - ognisko się kończy; nie ma wiele do zrobienia w tym momencie
    • Punkt C - drugie ognisko - rozpoczyna się drugie ognisko, należy zająć się praktykami bezpieczeństwa biologicznego/przyczyną ponownego wystąpienia ogniska.
  • Do dalszego określenia stadium ogniska (wraz z historią kliniczną) może być potrzebne drugie pobranie próbek od tych samych zwierząt 10 dni do 2 tygodni później
    • Jeżeli wyniki drugiej próbki są wyższe, to prawdopodobnie w punkcie A
    • Jeżeli wyniki drugiej próbki są znacznie wyższe, to prawdopodobnie w punkcie C
    • Jeśli wyniki drugiej próbki nie zmieniają się, to prawdopodobnie w fazie plateau
    • Jeśli wyniki drugiej próbki spadają, to prawdopodobnie w punkcie B

• Wysokie wartości S:P mogą być często związane z niedawnym narażeniem.
  • Szczególnie po drugim narażeniu lub szczepieniu przypominającym (patrz ryc. 2) (dotyczy ELISA na obecność przeciwciał)
  • Należy zauważyć, że sam fakt niedawnego zakażenia nie oznacza, że patogen jest nadal obecny (tj. zwierzę jest wiremiczne lub ma bakterie) (dotyczy ELISA na obecność przeciwciał)
    • Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku wirusa PRRS (zespół rozrodczo- oddechowy świń).
      • Świnie mogą mieć ujemne wyniki ELISA, a mimo to być wiremiczne.
      • Świnie mogą mieć wysokie wartości ELISA dla przeciwciał i nie mieć wiremii.
      • Test PCR jest stosowany do ustalenia statusu wiremii zwierząt
• Niskie wartości S:P
  • Poszczególne choroby mogą nie stymulować wystarczającej liczby przeciwciał do wykrycia
    • Mycoplasma hyopneumoniae przyczepia się głównie do rzęsek w płucach i nie stymuluje wysokiej produkcji IgG w surowicy
      • Ostatnie zakażenie w terenie daje znacznie silniejsze wyniki ELISA
    • Szczepionki przeciwko Mycoplasma hyopneumoniae nie stymulują silnej odpowiedzi immunologicznej IgG
      • Różne ELISA różnie wykrywają szczepionki
      • Zazwyczaj tylko około 30% zaszczepionych zwierząt ulega serokonwersji
  • Świnie leczone antybiotykami przez kilka tygodni mogą w tym czasie mieć hamowany wzrost bakterii, zmniejszając w ten sposób narażenie na chorobę (ale nie eliminując jej), co skutkuje wolniejszą lub słabszą odpowiedzią immunologiczną na narażenie.
    • Stosowanie antybiotyków przeciwko Mycoplasma hyopneumoniae we wczesnym i średnim okresie poodsadzeniowym
    • Stosowanie antybiotyków przeciwko patogenom jelitowym, takim jak Lawsonia intracellularis we wczesnym i średnim okresie poodsadzeniowym