Test PCR jako narzędzie diagnostyczne (2/2): zastosowania i interpretacja wyników

Niektóre zastosowania PCR:

• Wykrywanie obecności DNA/RNA wybranego patogenu - najczęstsze zastosowanie
• Serotypowanie patogenu poprzez ukierunkowanie na określone geny (DNA/RNA), o których wiadomo, że różnią się między serotypami (np. geny biosyntezy otoczki dla Actinobacillus pleuropneumoniae)
• Wykrywanie obecności genów wirulencji (np. genotypowanie E. coli)

Należy pamiętać, że testy PCR wykrywają jedynie obecność docelowego materiału genetycznego w oparciu o startery i nie wskazują, czy wykryty materiał może być zakaźny czy nie. W przypadku badania genów, badanie wykrywa jedynie obecność genu, ale nie wskazuje, czy organizm wykazuje ekspresję wykrytego czynnika wirulencji.

W ostatnich latach laboratoria opracowały metodę multipleks PCR, która umożliwia jednoczesne badanie wielu patogenów, szczepów lub genów tego samego patogenu. Multipleks PCR to wielokrotne PCR przeprowadzane w tym samym czasie, wykrywając różne sekwencje. Ich koszt jest wyższy niż pojedynczych PCR, ale znacznie niższy niż przeprowadzenie każdego z PCR oddzielnie, ponieważ istnieją znaczne oszczędności dla laboratorium w zakresie wykorzystania sprzętu, personelu laboratoryjnego i wykorzystania odczynników. Laboratorium będzie używać różnych markerów, aby pomóc w identyfikacji, przez które startery zostały wykryte dodatnie wyniki. Często takie multipleksowe metody PCR mają sens, jak na przykład badanie genotypu E. coli, gdzie w tym samym czasie można ocenić 14 genów w tym samym izolacie bakteryjnym. Innym przykładem jest badanie zarówno PRRS typu 1 jak i typu 2 w tym samym czasie. Innym powszechnym schematem badania jest jednoczesne badanie na obecność epidemicznej biegunki świń i koronawirusa delta świń. Należy zauważyć, że opracowanie tych testów nie zawsze jest łatwe, ponieważ laboratorium musi upewnić się, że nie ma interferencji pomiędzy różnymi testami PCR. Oznacza to, że temperatury cykli i różne stosowane startery nie hamują się wzajemnie lub nie wchodzą ze sobą w reakcje krzyżowe. Każdy z tych multipleksowych PCR musi być zwalidowany przed użyciem i musi nastąpić znacząca optymalizacja testu.

Uwagi dotyczące interpretacji wyników:

Jednym z wyzwań związanych z testami PCR jest to, że często każde laboratorium ma inny protokół badania próbki, który może obejmować różnice w procesie ekstrakcji DNA/RNA, różnice w protokołach dotyczących samych cykli rekacji, jak również różnice w stosowanych starterach. Może to utrudniać dokładne porównanie wyników uzyskanych w różnych laboratoriach.

Wynik ujemny

• Sample/herd truly negative for pathogen
• Ensure proper sample was submitted for the targeted pathogen. Some classic examples to consider:
  • Influenza virus does not go systemic and thus will not be found in blood samples.
  • Oral fluid testing for Mycoplasma hyopneumoniae rarely provides a positive result as the pathogen is usually attached to cilia lower in the respiratory system
  • Submitting only 1 fetus from a PRRS abortion (only 50% chance of being positive), should submit at least 4 fetuses to maximize chances of finding a positive sample
• Sample collected too late in the disease and the pathogen is not present anymore.
  • Influenza virus present in nasal secretions only for first 3-4 days
• Primer mismatch
  • New PRRS strain
• Low prevalence in the herd and animal(s) sampled were not infected
  • Need to significantly increase the number of animals sampled
• Dilution of a weak positive sample due to pooling
  • Pooling of oral fluids which are traditionally already diluted samples (testing multiple pigs and already expected high Ct values in positive samples)
• Próbka/stado rzeczywiście ujemne pod kątem obecności patogenu
• Upewnij się, że dostarczono właściwą próbkę dla danego patogenu. Kilka klasycznych przykładów do rozważenia:
  • Wirus grypy nie przechodzi do ustroju i dlatego nie zostanie znaleziony w próbkach krwi.
    Z kolei badanie płynu ustnego na obecność Mycoplasma hyopneumoniae rzadko daje wynik dodatni, ponieważ patogen ten jest zwykle przytwierdzony do rzęsek znajdujących się niżej w układzie oddechowym.
  • Pobranie tylko 1 płodu z poronienia z podejrzeniem PRRS (tylko 50% szans na wynik pozytywny) -należy pobrać co najmniej 4 płody, aby zmaksymalizować szanse na uzyskanie dodatniej próbki
• Próbka pobrana zbyt późno w trakcie trwania choroby i patogen nie jest już obecny.
  • Wirus grypy jest obecny w wydzielinach nosowych tylko przez pierwsze 3-4 dni
• Niedopasowanie starterów
  • Nowy szczep PRRS
• Niska częstość występowania w stadzie, a zwierzęta, od których pobrano próbki, nie były zakażone
  • Potrzeba znacznego zwiększenia liczby zwierząt, od których pobierane są próbki
• Rozcieńczenie słabo dodatenij próbki w wyniku łączenia próbek
  • Łączenie płynów ustnych, które tradycyjnie są już rozcieńczonymi próbkami (jedna próbka z kojca to płyn ustny pochodzący od wielu świń i już spodziewane wysokie wartości Ct w dodatnich próbkach)

Wynik dodatni

• Próbka/stado rzeczywiście dodatnia pod kątem obecności patogenu
• Brak możliwości rozróżnienia, czy próbka jest zakaźna czy niezakaźna
• W zależności od docelowego patogenu, wykrycie DNA/RNA nie zawsze potwierdza chorobę
  • PCR dodatni dla Mycoplasma hyopneumoniae potwierdza obecność organizmu w tkance, ale nie potwierdza stopnia ciężkości lub klinicznego znaczenia patogenu. W większości stad (z wyłączeniem stad Mycoplasma- ujemnych) istnieje potrzeba wizualnego potwierdzenia procentowego uszkodzenia płuc (ocena makroskopowa) w celu określenia klinicznego znaczenia wyników.
  • Surowica dodatnia w badaniu PCR na obecność cirkowirusa świń typu 2 (PCV2) potwierdza obecność PCV2, ale nie potwierdza, czy wyniszczenie lub zapalenie płuc można przypisać PCV2 lub czy doszło do niepowodzenia szczepienia. Konieczne jest wykonanie badania immunohistopatologicznego płuc i tkanki chłonnej w celu wykazania choroby związanej z PCV2.
  • Test może nie być w stanie odróżnić wirusa/bakterii szczepionkowych ze zmodyfikowanej żywej szczepionki od zakażenia typu dzikiego.
    • Kluczowe znaczenie ma znajomość czasu i rodzaju zastosowanej szczepionki
    • Może być potrzebna informacja z sekwencjonowania
• Skażenie krzyżowe w przypadku niewłaściwego obchodzenia się z próbkami
  • Szczególnie przy łączeniu próbek. Łączenie próbek powinno odbywać się pod wyciągiem laboratoryjnym.
  • Próbki kału pobrane z podłogi mogą być zanieczyszczone krzyżowo pozostałościami środowiskowymi patogenu
• Niskie wartości Ct są związane z wysokim stężeniem wirusów/bakterii w próbce i często mogą być skorelowane z wyższym prawdopodobieństwem powiązania z chorobą kliniczną.
  • Niskie wartości Ct dla Lawsonia intracellularis w kale są bardziej prawdopodobne w przypadku zmian w jelitach.
    • Ct < 20 → Enteropatia proliferacyjna świń
    • Ct > 30 → Brak zmian w jelitach

Genotypowanie

• Genotypowanie metodą PCR staje się coraz bardziej powszechne, zwłaszcza w przypadku E. coli.
• Dostarcza ono informacji epidemiologicznych dotyczących zmian w izolatach mających wpływ na stado (np. grypa H1N1 vs H3N2).
• Często wyniki genotypowania są wykorzystywane przy wyborze szczepionki, np. w przypadku E. coli (potwierdzenie obecności fimbrii).
• Ważne jest aby pamiętać, że wyniki reprezentują tylko pojedynczy izolat i często świnie są zakażone wieloma izolatami w tym samym czasie.
• Wykrywanie potwierdza jedynie obecność genów wirulencji, ale nie potwierdza ich ekspresji. Często sama wiedza, że ma potencjał genetyczny do ekspresji genu jest wystarczająca.
• Wraz z dalszym spadkiem kosztów i łatwości sekwencjonowania genów, zmniejszy się wykorzystanie lub potrzeba genotypowania metodą PCR.