Diagnosi di Laboratorio: Virus dell'Influenza di tipo A (IAV)

Test disponibili:

Potrebbe essere utile rivedere l'eccellente sintesi fornita nell'Articolo sull'Influenza di Phil Gauger:

Patologia macroscopica

• Valuta la presenza di lesioni tissutali che possono suggerire la presenza di malattia.
• Ubicazione delle lesioni:
  • Consolidamento cranio-ventrale (specialmente nei lobi apicali e cardiaci)

• La presentazione può essere diffusa coprendo più aree del polmone.
• Potrebbe esserci edema inter-lobulare.

• Pro:
  • La gravità delle lesioni può essere correlata all'importanza clinica
• Contro:
  • Lesioni macroscopiche non diagnostiche (molto simili a Mycoplasma hyopneumoniae)
  • Ci sono spesso infezioni secondarie o co-infezioni

Istopatologia

• Valutata la presenza di lesioni che possono confermare la presenza della malattia.
• Tipo di campione: tessuto polmonare.
• Pro:
  • La bronchiolite necrotizzante è spesso considerata patognomonica dell'infezione da virus dell'influenza A nei suini.
  • Le lesioni caratteristiche compaiono pochi giorni dopo la diffusione del virus nei suini, specialmente in presenza di co-infezioni.
• Contro:
  • Valuta solo una piccola quantità di tessuto
  • Le lesioni non complicate possono risolversi rapidamente (5-7 giorni)

Immunoistochimica (IHC)

• Rileva la presenza di antigene virale.
• Tipo di campione: tessuto polmonare.
• Pro:
  • Rileva il virus nel sito della lesione (buona prova di causalità)
  • L'antigene bersaglio è solitamente una nucleoproteina che è conservata in tutti i virus dell'influenza A.
• Contro:
  • Valuta solo una piccola quantità di tessuto.
  • Il virus è presente solo per un breve periodo di tempo (pochi giorni)
  • Richiede una quantità significativamente maggiore di virus rispetto alla PCR

Isolamento del virus

• Isola il virus vivo.
• Tipi di campioni: tessuto polmonare, lavaggio broncoalveolare, tamponi nasali.
• Pro:
  • Gold Standard.
  • Isolamento del virus per l'uso nello sviluppo di vaccini (vaccini stabulogeni-autogenous vaccines) o test sierologici (inibizione dell'emoagglutinazione) per determinare la protezione crociata
• Contro:
  • Caro
  • Risultati lenti
  • Richiede uova di pollo embrionate o cellule di rene canino Madin-Darby (MDCK).
  • Il processo di inoculazione è molto laborioso
  • Spesso difficile da coltivare (molti falsi negativi)
  • La manipolazione dei campioni dal campo al laboratorio può influire sulla sopravvivenza del virus

Polymerase chain reaction (PCR)

• Rileva la presenza di una specifica sequenza di acido nucleico virale (RNA).
• Tipi di campioni: tamponi nasali, fluidi orali, tessuto polmonare, lavaggio bronco-alveolare.
• Pro:
  • I primers possono essere progettati per:
    • Rilevamento di tutti i sottotipi di virus dell'influenza A, mirati alla nucleoproteina conservata
    • Rilevamento di gruppi di virus di sottotipi specifici: sottotipo H1, H3, N1 o N2
  • Alta sensibilità
  • Rilevamento precoce
  • La quantificazione mediante PCR è associata alla presenza di lesioni
  • Costo moderato
    • I campioni di tamponi o di tessuto possono spesso essere combinati per ridurre i costi e minimizzare la perdita di sensibilità (soprattutto per quanto riguarda la rilevanza clinica)
• Contro:
  • Elevata sensibilità - soprattutto nei fluidi orali può rilevare la presenza di piccole quantità di virus nell'allevamento, rendendo difficile l'interpretazione clinica dei risultati rispetto all'estensione o alla gravità della malattia.
  • Il virus è presente nell'ospite solo per pochi giorni (3-5 giorni soprattutto nei tamponi nasali).
  • I campioni di sangue o siero non possono essere utilizzati per il test PCR, poiché il virus rimane nel polmone e non è sistemico.

Sequenziamento genetico

• Sequenza dei segmenti genetici dell'acido nucleico (RNA) del virus.
• Tipi di campioni: tessuto polmonare, tamponi nasali, lavaggio bronco-alveolare, fluidi orali.
• Pro:
  • Consente la differenziazione tra sottotipi a molti diversi livelli di cladi
    • H1: è suddiviso in cladi che solitamente vengono denominati con l'alfabeto greco (alfa, beta, gamma, ecc.)
    • H3: è suddiviso in clusters che solitamente vengono denominati con numeri romani (I, IV, ecc.)
    • Molti di questi cladi o cluster rilevanti si Descrivono QUI.
  • Può aiutare a differenziare l'introduzione di nuovi virus dai virus esistenti o passati.
  • Può aiutare a selezionare i ceppi vaccinali in base al sottotipo/clade
• Contro:
  • Caro
  • Di solito viene sequenziato solo il gene HA
  • La variabilità tra sottotipi/cladi continua a crescere e sta diventando più complessa

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

• Rileva la presenza di anticorpi.
• Tipo di campione: siero.
• Pro:
  • I test ELISA possono essere elaborati per:
    • Rilevamento di anticorpi di tutti i sottotipi - diretto alla nucleoproteina conservata
    • Rilevazione di anticorpi specifici per sottotipo - diretti alle proteine ​​​​specifiche emoagglutinina (indicate come H o HA) e/o neuraminidasi (indicate come N o NA)
  • Gli animali rimangono positivi per diverse settimane (iniziano a diminuire dopo 8-10 settimane)
  • Può essere utilizzato nei casi cronici
• Contro:
  • Gli anticorpi specifici e il tempo di rilevamento possono variare leggermente tra i diversi kit commerciali disponibili.
  • Gli animali impiegano 10-14 giorni per diventare sieropositivi
  • Non distingue tra vaccinazione e infezione da virus di campo
  • Non identifica un sottotipo specifico di virus

Hemagglutination Inhibition (HI)

• Rileva la presenza di anticorpi.
• Tipo di campione: siero.
• Pro:
  • Gli animali rimangono positivi per diverse settimane
  • Può essere utilizzato nei casi cronici
  • Può essere utilizzato per determinare il momento appropriato per la vaccinazione evitando l'interferenza degli anticorpi materni.
  • Può essere utilizzato per determinare la protezione crociata tra i ceppi
• Contro:
  • Ogni test è ceppo specifico
  • Richiede l'isolamento del ceppo specifico per valutare la protezione crociata
  • ​Gli animali impiegano 10-14 giorni per diventare sieropositivi
  • Non distingue tra vaccinazione e infezione da virus di campo

Interpretazione dei risultati:

Patologia macroscopica

• Positivo: Conferma della presenza di polmonite.
• Negativo: I primi casi possono non manifestare estese lesioni polmonari.

Istopatologia

• Positivo: Conferma della malattia.
• Negativo: Negativi o le lesioni non vengono rilevate se viene testato il campione sbagliato o eseguito molto tempo dopo l'infezione.

IHC

• Positivo: Il virus è presente nel sito della lesione.
• Negativo: Negativo o il virus non viene rilevato se il test viene eseguito molto tempo dopo l'infezione o la concentrazione del virus è troppo bassa (è presente solo per un breve periodo di tempo).

Isolamento del virus

• Positivo: Conferma della malattia.
• Negativo: Il virus non viene rilevato se il test viene eseguito molto tempo dopo l'infezione o semplicemente non può crescere a causa di altra contaminazione o una cattiva manipolazione (presente ma molto difficile da coltivare).

PCR

• Positivo: Conferma della malattia.
• Negativo: Negativo, il virus non viene rilevato se il test viene eseguito molto tempo dopo l'infezione o a causa di un'errata selezione o manipolazione del campione.​
• Inconcludente: virus presente molto poco o coinfezione con più di un sottotipo.

Sequenziamento genetico

• Permette di identificare il sottotipo e il clade del virus.
• Consente di regolare il ceppo vaccinale per una migliore protezione.

ELISA

• Positivo: Anticorpi materni o precedente esposizione (> 2 settimane) al vaccino o al virus di campo.
• Negativo:
  • Negativo al vaccino o al virus di campo
  • Infezione troppo recente per essere rilevata (10-14 giorni alla sieroconversione)
  • Incompatibilità tra test e virus (sottotipo o clade)

HI

• Positivo: Anticorpi materni o precedente esposizione (> 2 settimane) al vaccino o al virus di campo.
• Negativo:
  • Negativo al vaccino o al virus di campo
  • Infezione troppo recente per essere rilevata (10-14 giorni alla sieroconversione)
  • Incompatibilità (sottotipo o clade) tra il virus utilizzato nel test e il virus che infetta il suino

In pratica:

Suini da ingrasso con starnuti e sintomi respiratori (acuti o cronici):

• Raccogliere 2-4 campioni di fluido orale dal gruppo e analizzarli mediante PCR.
• Raccogliere 12 tamponi nasali da suini infetti con segni clinici (hanno secrezione nasale chiara), creare 3 pool di 4 campioni ciascuno e analizzarli mediante PCR.
• Sequenziare un campione PCR positivo per determinare meglio il cluster/clade.

Determinazione del tempo di esposizione ed eventuale necessità di vaccinazione:

• Raccogliere campioni da 10-15 suini a 3, 6, 9 e 12 settimane di età.
• Due approcci per la raccolta:
  • Trasversale: raccoglie contemporaneamente da diversi gruppi di età (ottiene risultati più velocemente).
  • Longitudinale – raccogliere dagli stessi suini nel tempo (si ottengono risultati più accurati).
• Analisi di campioni di siero mediante ELISA.
• Raccogliere 2-4 campioni di fluido orale dal gruppo e analizzarli mediante PCR.
• Sequenza di un campione positivo alla PCR da ciascun gruppo di età per determinare ulteriormente il cluster/clade.