Metodo LAMP: un'alternativa semplice, veloce ed economica alla PCR?

I test basati sulla rilevazione degli acidi nucleici sono diventati il ​​test di scelta per rilevare la presenza di agenti patogeni nei campioni diagnostici. La reazione a catena della polimerasi o PCR è una procedura di analisi degli acidi nucleici ampiamente utilizzata nei laboratori diagnostici e di ricerca. La PCR è una procedura che amplifica un minuscolo frammento di DNA fino al punto in cui è rilevabile come banda su una striscia di gel o come segnale fluorescente rilevabile dalla macchina e può essere eseguita in poche ore. Per eseguire una buona PCR è necessario un investimento significativo in attrezzature, come termo-ciclatori ( thermocyclers), un laboratorio specializzato e personale formato ed esperto.

Cos'é il metodo LAMP?

Il metodo LAMP (in inglese, Loop-mediated isothermal amplification) è un metodo semplice, veloce, sensibile ed accurato di rilevamento e amplificazione del DNA/RNA che non richiede apparecchiature sofisticate ed è relativamente poco costoso. La reazione viene condotta in una provetta per microcentrifuga. L'attrezzatura necessaria per il metodo LAMP è semplice: una pipetta, puntali monouso e un bagno a secco digitale. Un bagnomaria o una comune incubatrice, o anche un thermos con acqua calda, possono essere sufficienti come fonte di calore, ma per facilitare l'igiene del laboratorio è altamente consigliato un termoblocco digitale (Figura 1).

In una tipica applicazione LAMP, la miscela in provetta conterrà:

• Sei frammenti di DNA chiamati primers che coincidono con la sequenza di DNA che si va a rilevare.
• Enzima specifico della polimerasi (ad esempio, BST DNA polimerasi)
• Buffers
• Reagenti di supporto
• Un colorante indicatore (indicatore di pH o colorazione diretta del DNA)
• Trascrittasi inversa per virus a RNA
• Il campione da analizzare.

Questa miscela viene incubata a 60-65°C per 30 minuti. Se nel campione è presente del DNA che corrisponde ai primer, si formano una serie di anse di DNA. I loop diventano più complessi e numerosi con il progredire della reazione di amplificazione (Figura 2).

L'amplificazione della polimerasi come sottoprodotto produce pirofosfato di magnesio che provoca torbidità (opacità) nel tubo. I marcatori colorati che si legano direttamente al DNA danno un segnale fluorescente nello spettro visibile o UV. Un sistema LAMP che utilizza un indicatore di pH rosso fenolo passa dal rosso rosato al giallo.

La Figura 3 mostra il risultato di un test LAMP per la peste suina africana (PSA) - La provetta A conteneva estratto dalla milza di una scrofa morta di PSA. L'alto contenuto di DNA virale genera un colore giallo opaco. La provetta B era un tampone di fluido orale della stessa scrofa, con la carica virale più bassa attesa. Osservando la linea di base è evidente la torbidità nelle provette A e B. Le provette da C a F sono sospette e negative.

Esistono alcune variazioni della reazione LAMP a seconda della tecnologia disponibile. Il test può essere applicato in micropiastre sigillate a 96 pozzetti con coloranti colorimetrici o fluorescenti o misurazioni della torbidità per un risultato quantitativo automatizzato. Le fotocellule filtrate nel blocco termico e un LED adatto potrebbero anche automatizzare la lettura fluorescente semiquantitativa in tempo reale dei tubi per microcentrifuga. La spettrofotometria con la fotocamera del cellulare potrebbe risolvere i dubbi sui tubi sospetti in quei casi in cui l'occhio umano non riesce a risolvere il dubbio.

La reazione LAMP può essere eseguita sul campo, in situ, per comodi risultati "Point-of-Care" con un'attesa minima. Il nostro laboratorio ha costruito e verificato test LAMP economici (da "zero" e da kit) per peste suina classica (PSC), circovirus suino 2 (PCV2) e peste suina africana (come sopra). Volevamo convalidare l'idea (per PSC) che un lotto di riproduttori potesse essere testato economicamente prima dell'introduzione per l'infezione persistente utilizzando il metodo LAMP.

I vantaggi del metodo LAMP sono la rapidità dei risultati, la formazione minima richiesta, il basso investimento in attrezzature, lo spazio ridotto che occupa in laboratorio e il basso costo complessivo per campione. Sebbene i costi possano variare, il costo del metodo LAMP è circa la metà del costo della PCR ed è ulteriormente ridotto per matrici semplici in cui non è necessaria una precedente estrazione dell'acido nucleico. I laboratori che vogliono investire nello sviluppo del metodo LAMP da zero con reagenti relativamente poco costosi e set di primer propri possono evitare il costo più elevato di un kit pronto all'uso, ma devono sostenere i costi associati allo sviluppo, alla verifica e alla certificazione.

La sensibilità e la specificità del metodo LAMP è paragonabile a quella della PCR e può dare risultati in 30 minuti. Alcune amministrazioni hanno approvato kit di test LAMP commerciali per PSA e Covid-19.

Tra gli svantaggi del metodo LAMP include la mancanza di conoscenza da parte di alcuni accademici e ricercatori e un certo scetticismo sul metodo. LAMP richiede 6 (fino a 8) primer per ogni gene da rilevare e la generazione di primer è più difficile della PCR convenzionale, ma ci sono strumenti online. Per virus a RNA altamente mutabili come la PRRS, possono essere necessari più set di primer nella miscela, ma ciò non ne ha impedito l'uso. Il metodo LAMP genera molto DNA e generalmente le provette positive non devono essere aperte dopo il test per evitare la contaminazione del laboratorio. Gli ampliconi LAMP non sono facilmente sequenziabili e il laboratorio potrebbe dover ricorrere alla PCR convenzionale o ad altri metodi per i campioni LAMP-positivi quando è richiesto il sequenziamento del virus.

È facile immaginare l'applicazione del metodo LAMP negli allevamenti zootecnici, nelle raccolte animali e nei macelli, così come negli ambienti più rudimentali e remoti dove non è possibile spostare attrezzature sensibili e costose. Quando non sono disponibili strutture sofisticate o persino elettricità e le risposte binarie sì/no sono un must per il processo decisionale in tempo reale e sul campo, il metodo LAMP potrebbe fornire una soluzione. A causa del basso costo e della mancanza di attrezzature, potrebbe aver ostacolato in una certa misura la proliferazione di LAMP, poiché alcune aziende e laboratori universitari potrebbero preferire strutture più costose, dando maggiore importanza al ritorno marginale dell'investimento rispetto al costo reale delle attrezzature, servizi di analisi veterinarie a pagamento.

Mentre il mondo si muove verso il controllo e l'eradicazione delle principali malattie endemiche transfrontaliere come la peste suina africana (PSA), la sindrome respiratoria suina (PRRS) e la peste suina classica (PSC), la disponibilità di un test rapido, comodo e conveniente ha un grande potenziale per l'uso.

"Forse essere troppo pratici è da pazzi” - Miguel de Cervantes Saavedra (1547-1616), Don Chisciotte.