Il test ELISA come strumento diagnostico (2/2): Interpretare i risultati

Considerazioni sull'interpretazione dei risultati:

• I suini esposti ad un agente patogeno (di campo o vaccinale) impiegano tempo per produrre anticorpi sufficienti per essere rilevati dall'ELISA (di solito almeno 2-4 settimane dopo l'esposizione, a seconda dell'agente patogeno e dell'anticorpo che stiamo cercando)
• I test anticorpali ELISA non sono in grado di distinguere tra anticorpi materni (passivi) e quelli causati dall'esposizione (attivi).
• I test ELISA per gli anticorpi spesso non sono in grado di differenziare gli anticorpi prodotti da un vaccino da quelli prodotti dall'esposizione a un ceppo di campo.
• In alcuni casi possono essere sviluppati test ELISA speciali, che consentono di differenziare gli animali infetti da quelli vaccinati (se si utilizzano i vaccini DIVA).
• I risultati dell'ELISA sugli anticorpi non implicano protezione. La protezione può provenire da anticorpi diversi, che non sono necessariamente quelli misurati nel test, o dall'immunità cellulo-mediata, che è completamente diversa dall'immunità umorale o mediata da anticorpi e non viene misurata da un test ELISA.
• L'ELISA dell'antigene è significativamente meno sensibile (bassa sensibilità analitica) nella rilevazione degli antigeni rispetto alla PCR. La PCR replica attivamente il DNA/RNA presente, quindi può rilevare un numero estremamente basso di virus o batteri. D'altra parte, l'ELISA degli antigeni richiede una concentrazione significativamente più alta di virus o batteri per poter creare un cambiamento di colore rilevabile.
• Quando vengono utilizzati ELISA commerciali (facili da trovare e da utilizzare), i risultati sono standardizzati e generalmente coerenti tra i laboratori. I test ELISA creati internamente al laboratorio possono produrre un'ampia variabilità di risultati a meno che il loro protocollo di produzione non sia altamente standardizzato e rigorosamente seguito.
• Non tutti i patogeni producono una risposta immunitaria che può essere misurata
• Normalmente ogni kit ELISA testerà proteine ​​diverse, che possono produrre risultati molto diversi per lo stesso campione. Un chiaro esempio sono le grandi differenze nei kit per rilevare gli anticorpi contro il Mycoplasma hyopnemoniae; evidentemente, non tutti i kit sono uguali.
• La dose e/o la via di esposizione possono influenzare il livello della risposta immunitaria (livello di produzione di anticorpi)
• È importante conoscere la sensibilità del test (capacità di rilevare i veri positivi) e la sua specificità (capacità di identificare i veri negativi come negativi; senza reazioni crociate)
• Possono verificarsi falsi positivi e falsi negativi perché la quantità di esposizione e risposta immunitaria agli agenti patogeni varia tra i singoli suini (distribuzione normale) e spesso vi è una reattività di fondo o crociata che non può essere completamente eliminata (vedi figura 1).
• Gli anticorpi sono generalmente presenti/rilevabili per diversi mesi dopo l'esposizione/vaccinazione

Risultati negativi

• Campione/allevamento veramente negativo per l'agente patogeno (nessuna esposizione o vaccino)
• Il campionamento dell'allevamento è in realtà negativo per l'agente patogeno, sebbene gli animali possano essere stati vaccinati (se il test ha capacità DIVA) (solo nei test ELISA per gli anticorpi)
• Non c'è abbastanza antigene presente nel campione per la sua rilevazione (solo nei test ELISA degli antigeni)
• Il campione è stato raccolto troppo presto ed il suino non è stato ancora in grado di attivare una risposta immunitaria (solo nei test ELISA per gli anticorpi)
  • La PRRS richiede spesso 7-10 giorni per la sieroconversione
  • Lawsonia intracellularis spesso richiede 4-6 settimane per la sieroconversione, a seconda della dose di esposizione
• Il campione è stato prelevato troppo tardi e l'agente patogeno non è più presente
  • Il virus dell'influenza è presente nelle secrezioni nasali solo per i primi 3-4 giorni
• Stiamo cercando l'anticorpo/antigene sbagliato
  • Diversi ceppi di influenza (differenze tra H1N1 e H3N3 e anche tra diversi clade di H1N1)
• La bassa prevalenza nell'allevamento e l'/gli animali campionati sono risultati negativi
  • Aumentare il numero di animali campionati
• Una particolare malattia potrebbe non stimolare abbastanza anticorpi per il rilevamento
  • Mycoplasma hyopneumoniae aderisce principalmente alle ciglia polmonari e non stimola un'elevata produzione sierica di IgG
    • Una recente infezione di campo produce risultati ELISA molto più forti
  • I vaccini nei confronti del Mycoplasma hyopneumoniae non stimolano una forte risposta immunitaria IgG
    • Diversi test ELISA rilevano i vaccini in modo diverso
    • Normalmente, solo il 30% degli animali vaccinati sieroconverte.
• Un campione debolmente positivo verrà diluito se raggruppato ad altri
  • Si consiglia vivamente di NON raggruppare (pooling) i campioni per il test elisa!

Campione positivo

• Campione/allevamento davvero positivo all'esposizione al patogeno
• Impossibile distinguere se il campione è infettivo o non infettivo
• Incapace di differenziare gli anticorpi materni dall'esposizione naturale o dalla vaccinazione
  • La maggior parte degli anticorpi materni scompare entro 8-12 settimane di età
  • Man mano che i suini crescono, i valori ELISA dovrebbero essere notevolmente ridotti
  • È possibile eseguire test seriali per confermare la scomparsa degli anticorpi materni e la mancanza di esposizione a ceppi di campo (nessuna nuova infezione)
• A seconda dell'agente patogeno che stiamo cercando, il rilevamento della proteina (antigene/anticorpo) non conferma sempre la malattia
  • Il siero che risulta positivo al circovirus suino di tipo 2 (PCV2) mediante ELISA per gli anticorpi conferma l'esposizione al PCV2, sia per vaccinazione che per infezione (entrambi i casi sono abbastanza comuni), ma non conferma se il deperimento o la malattia sia attribuibile al PCV2 o se vi sia stato un fallimento del vaccino. L'immunoistopatologia del tessuto polmonare e/o linfoide è necessaria per dimostrare la malattia associata al PCV2.
  • Il test potrebbe non essere in grado di differenziare l'esposizione a virus/batteri vaccinali di un vaccino vivo modificato da un'infezione di campo (solo ELISA per anticorpi)
    • Si applica sia ai vaccini morti che vivi modificati
    • È utile per conoscere il momento in cui viene applicato il vaccino, anche se non è critico, poiché gli animali possono rimanere positivi ad alcune malattie per un lungo periodo di tempo (molti mesi).
• Le contaminazioni crociate sono poco probabili poiché è necessaria una grande quantità di contaminazione per produrre un risultato positivo (dipende dalla concentrazione)

• È possibile che, con un semplice valore ELISA, non sia possibile identificare completamente lo stadio dell'infezione (è necessaria l'anamnesi, vedere figura 2)
  • X = valore ELISA
  • Ci sono tre diversi momenti di un focolaio che possono produrre lo stesso valore ELISA, ma l'interpretazione e le azioni da intraprendere sarebbero molto diverse:
    • Punto A – Inizio dell'infezione: l'epidemia è appena iniziata; si possono intraprendere azioni
    • Punto B – Fine dell'infezione – l'epidemia sta finendo; non posso più fare molto
    • Punto C – Secondo focolaio – Al via un secondo focolaio. Dovrebbero essere esaminate le misure di biosicurezza o le cause del ricircolo.
  • Potrebbe essere necessario un secondo campione degli stessi animali in 10 giorni - 2 settimane per completare la determinazione dello stadio in cui ci troviamo (insieme alla storia clinica)
    • Se i risultati del secondo test sono superiori, probabilmente siamo al punto A
    • Se i risultati del secondo test sono molto più alti, probabilmente siamo al punto C
    • Se i risultati del secondo test non cambiano, siamo probabilmente in una fase di stallo
    • Se i risultati del secondo test diminuiscono, siamo probabilmente al punto B
• Alcuni valori S:P elevati spesso possono essere associati a un'esposizione più recente.
  • Soprattutto dopo una seconda esposizione o una vaccinazione di richiamo (vedi Figura 2) (solo ELISA per anticorpi)
  • È importante notare che solo perché un'infezione è recente non implica che l'agente patogeno sia ancora presente (cioè l'animale è viremico o batteriemico) (solo ELISA per anticorpi)
    • Ciò è particolarmente vero per il virus della Sindrome Riproduttiva e Respiratoria Suina (PRRS).
      • I suini possono essere ELISA negativi e ancora viremici
      • I suini possono avere titoli anticorpali elevati nell'ELISA e non essere viremici
      • Per stabilire il livello di viremia negli animali, viene utilizzata la PCR
• Valori S:P bassi
  • È possibile che una specifica malattia non stia stimolando abbastanza anticorpi per rilevarla
    • Mycoplasma hyopneumoniae aderisce principalmente alle ciglia polmonari e non stimola un'elevata produzione sierica di IgG
      • Una recente infezione di campo produce risultati ELISA più forti
    • I vaccini nei confronti del Mycoplasma hyopneumoniae non stimolano una forte risposta IgG
      • Diversi test ELISA rilevano i vaccini in modo diverso
      • Normalmente solo il 30% circa degli animali vaccinati sieroconverte
  • I suini trattati con antibiotici per diverse settimane possono sopprimere la crescita batterica durante questo periodo, diminuendo l'esposizione alla malattia (ma non eliminandola), portando ad una risposta immunitaria più bassa o più debole all'esposizione
    • Usare antibiotici vs Mycoplasma hyopneumoniae all'inizio o a metà dello svezzamento
    • Usare antibiotici vs patogeni enterici come la Lawsonia intracellularis all'inizio o a metà dello svezzamento.