Il test ELISA come strumento diagnostico (1/2): Principi di base

L'uso del test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA enzyme-linked immunoassay) per il rilevamento di proteine ​​(antigeni o anticorpi) è uno degli strumenti più facilmente disponibili in tutto il mondo ed è attualmente ampiamente utilizzato nella produzione di suini. Il test è comunemente usato nella sorveglianza e nel monitoraggio delle malattie, nonché come strumento diagnostico. Poiché è ampiamente utilizzato dai veterinari suini, è essenziale capire come funziona, cosa rileva ed i suoi vantaggi o svantaggi nell'interpretazione dei risultati. È anche importante ricordare che, sebbene la stessa tecnologia venga utilizzata contro agenti patogeni diversi, i risultati devono essere interpretati in modi diversi.

Informazioni del test

I test ELISA sono progettati per la rilevazione di antigeni o anticorpi contro batteri o virus. Gli antigeni sono proteine ​​estranee per l'organismo che stimolano la produzione di anticorpi (in inglese significa "generatore di anticorpi").: antigen = antibody generator). Quando si pensa agli anticorpi, bisogna tenere a mente che sono sempre contro le proteine. Durante la progettazione del test, il produttore o il laboratorio decide quale proteina o proteine ​​specifiche saranno prese di mira. Se l'ELISA mira direttamente a una proteina sul batterio o sul virus, viene chiamato ELISA di antigeni, mentre, se l'obiettivo è la risposta anticorpale dell'animale contro il batterio o il virus, è noto come ELISA di anticorpi. Sebbene ci siano test ELISA progettati per colpire solo una o due proteine ​​(anticorpi o antigeni), molti prendono di mira un gran numero di proteine. I test possono anche essere progettati per rilevare un tipo specifico di risposta anticorpale (IgG, IgM o IgA) o una loro combinazione. Ciascuno di questi tipi di anticorpi ha funzioni specifiche che esulano dallo scopo di questo articolo.

Il concetto e il processo per la rilevazione di anticorpi o antigeni mediante ELISA è esattamente lo stesso. Inizi prendendo la proteina bersaglio (antigene o anticorpo). Per le singole proteine, è necessario un processo separato per ottenere una concentrazione purificata di questa particolare proteina. Identificare quale proteina o proteine ​​mirare è un processo scientifico e complesso. Idealmente, il test mira a una singola proteina che è unica per l'agente patogeno di interesse (non reagisce in modo crociato con altri agenti patogeni), è altamente immunogenica (per il rilevamento degli anticorpi) o si trova in alte concentrazioni (per il rilevamento dell'antigene); prende di mira una proteina che è nota per essere altamente correlata alla protezione contro le malattie e sarà sempre presente. Sfortunatamente, la maggior parte di questi criteri è sconosciuta e viene utilizzata una singola proteina, che può essere facilmente prodotta e trovata nel campione, o una miscela di più proteine ​​(virus o batteri interi). Sebbene l'uso di virus o batteri interi possa essere facile, è più probabile che reagiscano in modo crociato con altri agenti patogeni.

Fasi generali del processo (vedere figura 1).

• Step 1. I micro-pozzetti sono pre-rivestiti con antigene(i) target (per rilevare gli anticorpi) o anticorpi (per rilevare gli antigeni).
• Step 2. I campioni da analizzare vengono aggiunti e incubati per consentire il legame tra gli antigeni e gli anticorpi.
• Step 3. Il campione viene prelevato e vengono aggiunti speciali anticorpi che aderiranno al lato opposto degli anticorpi (parte inferiore della “Y” dell'anticorpo nella rilevazione degli anticorpi) o degli antigeni (parte superiore della “Y” nella rilevazione degli antigeni). Il campione viene quindi incubato per consentire il legame e poi lavato per garantire che gli anticorpi o gli antigeni non aderenti (cioè non bersaglio) vengano rimossi.
• Step 4. Viene aggiunto l'anticorpo che viene marcato con un rivelatore che emette fluorescenza e si attaccherà agli anticorpi speciali dello step 3 (si attacca alla parte inferiore della "Y" sull'anticorpo; è lo stesso bersaglio sia per il rilevamento degli antigeni che degli anticorpi). ). A quel punto, il campione viene nuovamente incubato per consentire il legame e lavato nuovamente per garantire che gli anticorpi marcati che non hanno aderito vengano rimossi.
• Step 5. Il reagente che attiverà la fluorescenza degli anticorpi marcati viene aggiunto e quindi incubato per garantire il legame.
• Step 6. Il campione viene letto, solitamente utilizzando una macchina speciale calibrata a una specifica lunghezza d'onda per quantificare il cambiamento di colore (denominato assorbanza). Ci sono alcune lievi variazioni a questo processo a seconda che si tratti di un ELISA diretto, indiretto o sandwich; ogni tipologia ha i suoi vantaggi e svantaggi (che qui non spieghiamo) ma, alla fine, ottengono tutti gli stessi risultati; maggiore è l'assorbanza o il cambiamento di colore, maggiore è la concentrazione prevista dell'antigene o dell'anticorpo bersaglio nel campione testato.

Nel caso di un ELISA competitivo, il punto chiave è che il processo utilizzato produrrà, di fatto, il risultato opposto (vedi Figura 2B). Il campione e una quantità nota di antigene marcato (per il rilevamento dell'antigene) o di anticorpi (per il rilevamento dell'anticorpo) vengono aggiunti al campione da testare in modo che, una volta aggiunti ai pozzetti marcati, sia il campione originale che le proteine ​​marcate che abbiamo aggiunto (anticorpi o antigeni) competono per attaccarsi al pozzetto precedentemente rivestito. In breve, se non ci sono proteine ​​target nel campione da testare, tutte le proteine ​​marcate saranno in grado di legarsi al pozzetto, generando un forte cambiamento di colore. D'altra parte, se c'è un numero considerevole di proteine ​​bersaglio nel campione, competeranno (bloccheranno) le proteine ​​marcate per il legame. Quando il campione viene lavato, tutte le proteine ​​marcate che non sono riuscite a legarsi verranno rimosse. Pertanto, più anticorpi o antigeni ci sono nel campione, più impediranno alle proteine ​​marcate di legarsi, venendo eliminate nel lavaggio. Ciò implica una bassa assorbanza quando la concentrazione della proteina bersaglio nel campione è elevata che è l'opposto del caso precedente. Valori elevati suggeriscono una bassa concentrazione o un campione negativo e rendono impossibile quantificare la concentrazione di antigeni/anticorpi di campioni positivi.

Il punto di cut-off per ciascun test ELISA può essere diverso ed è preimpostato dal produttore in base alla sensibilità e specificità desiderate.. Per gli ELISAs diretta, indiretta o sandwich, qualsiasi numero maggiore del punto di cutoff è considerato positivo. Per un ELISA competitiva, qualsiasi numero maggiore del punto di cutoff è considerato negativo. In alcuni test, viene stabilita una zona grigia per classificare i campioni come "sospetti" poiché il test tende ad avere alcune reazioni "di fondo" (reazioni crociate) che rendono difficile avere un chiaro punto di cut-off.

I risultati vengono solitamente, ma non sempre, visualizzati come S:P corretto o percentuale di positività relativa al controllo positivo corretta per il cambiamento del colore di sfondo nei pozzetti di controllo negativo. I livelli di anticorpi sono spesso chiamati "titoli". Sebbene non sia tecnicamente corretto, può essere giustificato in prospettiva generale. Un punto chiave è che quando si parla di titoli c'è una relazione matematica diretta tra i valori (un valore di 20 ha il doppio degli anticorpi di un campione con un valore di 10). Con i valori ELISA, questa relazione matematica diretta non esiste (vedi Figura 2A). Un ELISA di 2.0 ha significativamente più anticorpi di uno di 1.0 e basta, non corrispondendo al "doppio".

Pooling dei campioni per l'analisi

Poiché i test ELISA dipendono dalla concentrazione (sono direttamente correlati alla concentrazione della proteina bersaglio [anticorpo o antigene]) il raggruppamento (pooling) di campioni è fortemente sconsigliato. Mettendoli in pool puoi aumentare significativamente la probabilità di perdere un campione positivo.

Alcuni usi dell'ELISA:

• Rileva la presenza di anticorpi contro specifici patogeni – ELISA-Anticorpi – È l'uso più comune.
• Determina l'esposizione ad un agente patogeno.
• Determina lo stato di vaccinazione di un animale.
• Determinare il timing dell'infezione (cambiamento del livello di anticorpi) nel tempo.
• Rileva la presenza di un patogeno bersaglio attraverso il rilevamento di proteine/antigene del patogeno bersaglio - ELISA-Antigene.