Il test PCR come strumento diagnostico (2/2): Usi e interpretazione dei risultati

Alcuni usi del test PCR:

• Rileva la presenza di DNA/RNA di un determinato agente patogeno – uso più comune.
• Sierotipizzazione di un patogeno per geni specifici (DNA/RNA) noti per variare tra i sierotipi (es. geni di biosintesi della capsula per Actinobacillus pleuropneumoniae).
• Rileva la presenza di geni di virulenza (es. genotipizzazione di E. coli).

E' importante ricordare che le PCR rilevano solo la presenza di materiale genetico specifico in base ai primer e non indicano se l'organismo possa essere infettivo o meno. Quando i geni vengono analizzati, il test rileva solo la presenza del gene, ma non conferma se l'organismo sta esprimendo il fattore di virulenza rilevato.

Negli ultimi anni, i laboratori hanno sviluppato multiplex PCR per analizzare diversi agenti patogeni o diversi ceppi o geni dello stesso agente patogeno contemporaneamente. Queste PCR multiplex sono più PCR in esecuzione contemporaneamente. Il loro costo è superiore ad una singola PCR, ma molto inferiore rispetto all'esecuzione di più PCR separatamente, poiché i laboratori hanno notevoli risparmi in termini di apparecchiature, personale di laboratorio e reagenti. Il laboratorio utilizzerà diversi marcatori per identificare quali risultati positivi corrispondono a ciascun primer. Molte volte queste PCR multiplex sono molto utili, come nella genotipizzazione dell'E. coli in cui è possibile analizzare contemporaneamente circa 14 geni nello stesso isolato batterico. Altri esempi sono l'analisi simultanea per PRRS tipo 1 e tipo 2 o per diarrea epidemica suina e delta coronavirus suino. È essenziale tenere presente che lo sviluppo di questi test non è sempre facile, poiché il laboratorio deve garantire che non vi siano interferenze tra le diverse PCR. Cioè, le temperature di ciclo ed i diversi primer utilizzati non si inibiscono o reagiscono in modo crociato tra loro. Ciascuna di queste multiplex PCR deve essere convalidate prima dell'uso e produrre un'ottimizzazione significativa del test.

Considerazioni nella interpretazione dei risultati:

Una delle maggiori sfide con la PCR è che ogni laboratorio ha spesso un protocollo diverso per l'analisi dei campioni, che può portare a differenze nel processo di estrazione del DNA/RNA, nei protocolli di ciclo e nei primer utilizzati. Ciò può rendere difficile il confronto dei risultati ottenuti in laboratori diversi.

Risultato negativo

• Campione/allevamento vero negativo per l'agente patogeno
• Assicurarsi di inviare i campioni appropriati per l'agente patogeno in questione. Alcuni esempi tipici da considerare:
  • Il virus dell'influenza non diventa mai sistemico, quindi non sarà trovato nei campioni di sangue
  • L'analisi per il Mycoplasma hyopneumoniae nei campioni di fluido orale raramente dà un risultato positivo poiché il patogeno si lega normalmente alle ciglia nel sistema respiratorio inferiore
  • Inviare solo un feto abortito con PRRS presuppone solo il 50% di possibilità di essere positivo. Almeno 4 feti dovrebbero essere inviati per massimizzare le possibilità di trovare un campione positivo
• Campione raccolto troppo tardi nel corso della malattia, quindi l'agente patogeno non è più presente
  • Il virus dell'influenza si trova nelle secrezioni nasali solo per i primi 3-4 giorni
• Incompatibilità del primer
  • Nuovo ceppo della PRRS
• Bassa prevalenza nell'allevamento e negli animali campionati non infetti
  • È necessario aumentare significativamente il numero di animali campionati
• Diluizione di un campione debole positivo a causa del raggruppamento di campioni o pooling.
  • Raggruppamento di fluidi orali che di solito sono campioni già diluiti (test su più suini e valori di Ct elevati già previsti in campioni positivi)

Risultato positivo

• Campione/allevamento realmente positivo per il patogeno.
• Impossibile differenziare se il campione è infettivo o non infettivo.
• A seconda dell'agente patogeno, il rilevamento del DNA/RNA non sempre conferma la malattia
  • Il tessuto polmonare PCR positivo per il Mycoplasma hyopneumoniae conferma la presenza dell'organismo nel tessuto, ma non la gravità o l'importanza clinica dell'agente patogeno. Nella maggior parte degli allevamenti (eccetto gli allevamenti negativi al Mycoplasma), la conferma visiva della percentuale di danno polmonare (valutazione macroscopica) è necessaria per determinare il significato clinico dei reperti.
  • Il siero PCR positivo per il circovirus suino di tipo 2 (PCV2) conferma la presenza del PCV2, ma non se il deperimento o la polmonite sono attribuibili al PCV2 o se si è verificato un fallimento del vaccino. L'immunoistopatologia del tessuto polmonare e/o linfoide è necessaria per dimostrare la malattia associata al PCV2.
  • Il test non distingue tra virus/batteri del vaccino vivo modificato e infezione di campo.
    • È importante conoscere il momento e il tipo di vaccino utilizzato.
    • Potrebbero essere necessarie informazioni sul sequenziamento.
• Contaminazione crociata se i campioni non vengono gestiti correttamente
  • Soprattutto quando si raggruppano i campioni. Il pooling dovrebbe essere fatto sotto una campana di laboratorio.
  • I campioni fecali raccolti dal pavimento possono essere contaminati dai resti ambientali dell'agente patogeno
• Bassi valori di Ct sono associati a un'elevata concentrazione di virus/batteri nel campione e spesso possono essere correlati con una maggiore probabilità di malattia clinica.
  • Valori di Ct bassi della Lawsonia intracellularis nelle feci probabilmente sono maggiormente correlati con lesioni intestinali.
    • Ct < 20 → Enteropatia proliferativa suina
    • Ct > 30 → Non si rilevano lesioni intestinali.

Genotyping

• L'uso della genotipizzazione con PCR è diventato più comune soprattutto per l'E. coli. Fornisce informazioni epidemiologiche sui cambiamenti nei ceppi che interessano l'allevamento (ad es. influenza H1N1 vs H3N2).
• I risultati della genotipizzazione vengono spesso utilizzati per selezionare il vaccino da utilizzare, come con l'E. coli (conferma dei pili).
• È importante ricordare che i risultati rappresentano solo un singolo ceppo e i suini sono spesso infettati con più ceppi contemporaneamente.
• Il rilevamento conferma solo la presenza di geni di virulenza, ma non la loro espressione. Molte volte basta sapere che ha il potenziale genetico per esprimere il gene.
• Poiché il costo e la facilità del sequenziamento genico continuano a diminuire, l'uso o la necessità di genotipizzazione con la PCR diminuirà.