PCR检测作为诊断工具（2/2）：结果的用途和解释

PCR 检测的一些用途：

• 检测目标病原体的DNA/RNA的存在-最常用
• 通过针对已知在不同血清型之间变化的特定基因（DNA/RNA）对病原体进行血清分型（例如胸膜肺炎放线杆菌的荚膜生物合成基因）
• 检测毒力基因的存在（例如，大肠杆菌基因分型）

重要的是要记住，PCR检测仅检测基于引物的目标遗传物质的存在，而不表明生物体是否具有传染性。在检测基因时，该检测仅检测基因的存在，而不检测生物体是否表达检测到的毒力因子。

近年来，实验室开发了多重PCR，以同时检测多种病原体或同一病原体的多个菌株或基因。多重PCR是同时运行多个PCR。它们的成本高于单个PCR，但比单独运行PCR的成本要低得多，因为实验室在设备使用、实验室人员和试剂使用方面节省了大量成本。实验室将使用不同的标记来帮助确定哪些阳性结果属于哪些引物。通常，这些多重PCR是有意义的，例如测试大肠杆菌基因分型，其中可以在同一细菌分离物上同时评估大约14个基因。另一个例子是同时测试1型和2型PRRS。另一种常见的检测方案是同时检测猪流行性腹泻和猪Delta冠状病毒。需要注意的是，这些分析的使用并不总是容易的，因为实验室需要确保不同PCR检测之间没有干扰。也就是说，循环温度和使用的不同引物不会相互抑制或交叉反应。这些多重PCR中的每一种都必须在使用前进行验证，并且必须对检测进行显著优化。

解释结果的注意事项：

PCR检测的挑战之一是，每个实验室的样本检测方案往往不同，其中可能包括DNA/RNA提取过程的差异、循环方案的差异以及所用引物的差异。这使得对从不同实验室获得的结果进行密切比较具有挑战性。

阴性结果

• 病原体真正呈阴性的样本/猪群
• 确保针对目标病原体提交了适当的样本。需要考虑的一些经典案例：
• • 流感病毒不会全身性传播，因此不会在血液样本中发现。
  • 猪肺炎支原体的口腔液体检测很少呈阳性结果，因为病原体通常附着在呼吸系统下部的纤毛上
  • 仅提交1个由PRRS导致流产的胚胎（阳性率仅为50%），应提交至少4个胚胎，以最大限度地提高发现阳性样本的几率
• 在疾病病程后期采集样本，病原体不再存在。
• • 流感病毒仅在鼻分泌物中存在3-4天
• 引物不匹配
  • PRR新毒株
• 猪群患病率低，抽样动物未感染
• • 需要显著增加采样的动物数量
• • 由于合并而稀释弱阳性样本
  • 合并传统上已稀释的口腔液样本（测试多头猪，阳性样本中预期的高Ct值）

阳性样本

• 病原体真正呈阳性的样本/猪群
• 无法区分样本是否具有传染性
• 根据靶向病原体的不同，检测DNA/RNA并不总是能确诊疾病
• • 猪肺炎支原体PCR阳性肺组织证实组织中存在该病原体，但不能证实该病原体的严重性或临床意义。在大多数猪群中（不包括支原体阴性猪群），需要目视确认肺损伤的百分比（总体评估），以确定结果的临床意义。
  • 对猪圆环病毒2型（PCV2）PCR检测呈阳性的血清证实了PCV2的存在，但不能确定消瘦或肺炎是否归因于PCV2，也不能确定是否发生了疫苗接种失败。需要对肺和/或淋巴组织进行免疫组织病理学检查，以证明与PCV2相关的疾病。
  • 该检测可能无法区分疫苗病毒/细菌、改良活疫苗和野生型感染。
  • • 了解使用疫苗的接种时间和类型至关重要
    • 可能需要测序信息
• 如果样品处理不当会造成交叉污染
• • 尤其是在合并样本时。合并应在实验室内进行。
  • 从地板上采集的粪便样本可能会被病原体的环境残留物交叉污染
• 低Ct值与样本中的高病毒/细菌浓度相关，通常与更高的临床疾病相关
• • 粪便中胞内劳森菌的低Ct值更可能与肠道病变有关。
  • • Ct < 20 → 猪增生性肠炎
    • Ct > 30 →未检测到肠道病变

基因分型

• PCR基因分型的使用越来越普遍，尤其是对大肠杆菌。它提供了有关影响猪群分离株变化的流行病学信息（例如H1N1流感与H3N2流感）。
• 基因分型结果通常用于帮助选择疫苗的使用，例如大肠杆菌（确认菌毛）。
• 重要的是要记住，结果只代表一个分离株，而且猪经常同时感染多个分离株
• 检测仅确认毒力基因的存在，但不确认其表达。通常只要知道它具有表达基因的遗传潜力就足够了。
• 随着基因测序的成本和易用性继续降低，PCR基因分型的使用或需要将减少。