Diagnóstico laboratorial: vírus da influenza tipo A (IAV)

Testes disponíveis:

Patologia macroscópica

• Avalia a presença de lesões teciduais que podem sugerir a presença da doença.
• Localização da lesão:
  • Consolidação cranioventral (especialmente nos lóbulos apical e cardíaco)

• A apresentação pode ser difusa cobrindo várias áreas do pulmão.
• Pode haver edema interlobular.

• Prós:
  • A gravidade das lesões pode estar relacionada à importância clínica.
• Contras:
  • Lesões macroscópicas não patognomônicas (muito similares a Mycoplasma hyopneumoniae).
  • Muitas vezes há infecções secundárias ou coinfecções.

Histopatologia

• Avaliar a presença de lesões que possam confirmar a presença da doença.
• Tipo de amostra: tecido pulmonar.
• Prós:
  • A bronquiolite necrosante é frequentemente considerada patognomônica da infecção pelo vírus influenza A em suínos.
  • As lesões características aparecem alguns dias após a disseminação do vírus em suínos, especialmente quando há coinfecções.
• Contras:

  • Avalia apenas uma pequena quantidade de tecido.

  • Lesões não complicadas podem resolver rapidamente (5-7 dias).

Imuno-histoquímica (IHC)

• Detecta a presença do antígeno viral.
• Tipo de amostra: tecido pulmonar.
• Prós:
  • Detecta o vírus no local da lesão (boa prova de causalidade).
  • O antígeno alvo é geralmente uma nucleoproteína que é conservada em todos os vírus influenza A.
• Contras:
  • Avalia apenas uma pequena quantidade de tecido.
  • O vírus está presente apenas por um curto período de tempo (alguns dias).
  • Requer uma quantidade significativamente maior de vírus do que a PCR.

Isolamento do vírus

• Isola o vírus vivo.
• Tipos de amostras: tecido pulmonar, lavado broncoalveolar, swabs nasais.
• Prós:

  • Critérios de referência.

  • Isolamento do vírus para uso no desenvolvimento de vacinas (vacinas autógenas) ou teste sorológico (inibição da hemaglutinação) para determinar a proteção cruzada.

• Contras:
  • Caro.
  • Resultados demorados.
  • Requer ovo de galinha embrionado ou célula de rim canino Madin-Darby (MDCK)
  • O processo de inoculação é muito laborioso.
  • É difícil cultivar (muitos falsos negativos)
  • A manipulação da amostra desde o campo até o laboratório pode afetar a sobrevivência do vírus.

Reação em cadeia de polimerase (PCR)

• Detecta a presença de uma sequência específica de ácido nucleico viral (RNA)
• Tipos de amostras: swabs nasais, fluidos orais, tecido pulmonar, lavado broncoalveolar.
• Prós:
  • Os primers (iniciadores) podem ser desenhados para:
    • Detecção de todos os subtipos de vírus da influenza A - visando a nucleoproteína conservada.
    • Detecção de grupos de vírus de subtipos específicos: subtipo H1, H3, N1 o N2.
  • Alta sensibilidade.
  • Detecção rápida.
  • A quantificação por PCR se associa com a presença de lesões.
  • Custo moderado.

    • Amostras de swab ou tecido geralmente podem ser combinadas para reduzir custos e minimizar a perda de sensibilidade (especialmente no que diz respeito à relevância clínica).

• Contras:
  • Alta sensibilidade – especialmente em fluidos orais, pode detectar a presença de pequenas quantidades de vírus na granja, dificultando a interpretação clínica dos resultados com relação à extensão ou gravidade da doença.
  • O vírus está presente no hospedeiro apenas por alguns dias (3-5 dias, especialmente em swabs nasais).
  • Amostras de sangue ou soro não podem ser utilizadas para o teste de PCR, pois o vírus permanece no pulmão e não é sistêmico.

Sequenciamento genético

• Sequenciar segmentos genéticos do ácido nucléico (RNA) do vírus.
• Tipos de amostras: tecido pulmonar, swabs nasais, lavado broncoalveolar, fluidos orais.
• Prós:
  • Permite a diferenciação entre subtipos em muitos níveis diferentes de clados
    • H1: é dividido em clados que geralmente são nomeados com o alfabeto grego (alfa, beta, gama, etc.)
    • H3: é dividido em grupos que geralmente são nomeados com algarismos romanos (I, IV, etc.)
    • Muitos desses clados ou grupos relevantes são descritos aqui.
  • Ele pode ajudar a diferenciar a introdução de novos vírus de vírus existentes ou antigos.
  • Pode ajudar a selecionar cepas de vacina com base no subtipo/clado.
• Contras:
  • Caro.
  • Normalmente apenas o gene HA é sequenciado.
  • A variabilidade entre subtipos/clados continua a crescer e está se tornando mais complexa.

Ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA)

• Detecta a presença do anticorpo.
• Tipo de amostra: soro.
• Prós:
  • Os testes ELISA podem ser projetados para:
    • Detecção de anticorpos de todos os subtipos - direcionados à nucleoproteína conservada.
    • Detecção de anticorpos específicos do subtipo - dirigidos às proteínas específicas hemaglutinina (referida como H ou HA) e/ou neuraminidase (referida como N ou NA)
  • Os animais permanecem positivos por várias semanas (começam a declinar após 8-10 semanas).
  • Pode ser usado em casos crônicos.
• Contras:
  • Os anticorpos específicos e o tempo de detecção podem variar ligeiramente entre os diferentes kits comerciais disponíveis.
  • Animais demoram de 10 a 14 dias para se tornar soropositivos.
  • Não distingue entre vacinação e infecção por vírus de campo.
  • Não identifica um subtipo específico de vírus.

Inibição da hemaglutinação (HI)

• Detecta a presença de anticorpos.
• Tipo de amostra: soro.
• Prós:
  • Os animais permanecem positivos por várias semanas.
  • Pode ser usado em casos crônicos.
  • Pode ser usado para determinar o momento adequado para a vacinação evitando a interferência de anticorpos maternos.
  • Pode ser usado para determinar proteção cruzada entre cepas.
• Contras:
  • Cada teste é específico da cepa.
  • Requer isolamento da cepa específica para avaliar a proteção cruzada.
  • Animais demoram de 10 a 14 dias para se tornar soropositivos.
  • Não distingue entre vacinação e infecção por vírus de campo.

Interpretação de resultados:

Patologia macroscópica

• Positivo: Confirmação da presença de pneumonia.
• Negativo: Os casos iniciais podem não manifestar lesões pulmonares extensas.

Histopatologia

• Positivo: Confirmação da doença.
• Negativo: Negativo ou lesões são perdidas se a amostra errada for testada ou testada muito tempo após a infecção.

IHC

• Positivo: O vírus está presente no local da lesão.
• Negativo: Negativo ou o vírus não é detectado se o teste for feito muito tempo após a infecção ou a concentração do vírus for muito baixa (está presente apenas por um curto período de tempo).

Isolamento do vírus

• Positivo: Confirmação da doença.
• Negativo: O vírus não é detectado se testado muito tempo após a infecção ou simplesmente não pode crescer devido a outra contaminação ou manuseio incorreto (presente, mas muito difícil de cultivar).

PCR

• Positivo: Confirmação da doença.
• Negativo: Negativo, o vírus não é detectado se o teste for realizado muito tempo após a infecção ou devido à seleção ou manuseio incorreto da amostra.
• Inconclusiva: Muito pouco vírus presente ou coinfecção com mais de um subtipo.

Sequenciamento genético

• Permite identificar o subtipo e o clado do vírus.
• Permite ajustar a cepa vacinal para melhor proteção.

ELISA

• Positivo: Anticorpos maternos ou exposição prévia (> 2 semanas) à vacina ou vírus de campo.
• Negativo:
  • Negativo para vacina ou vírus de campo.
  • Infecção muito recente para ser detectada (10-14 dias para soroconversão).
  • Incompatibilidade entre teste e vírus (subtipo ou clado).

HI

• Positivo: Anticorpos maternos ou exposição prévia (> 2 semanas) à vacina ou vírus de campo.
• Negativo:
  • Negativo para vacina ou vírus de campo.
  • Infecção muito recente para ser detectada (10-14 dias para soroconversão).
  • Incompatibilidade (subtipo ou clado) entre o vírus utilizado no teste e o vírus que infecta o suíno.

Casos clínicos:

Suínos de terminação com espirros e sinais respiratórios (agudos ou crônicos):

• Coletar 2-4 amostras de fluido oral do grupo e analisar por PCR.
• Coletar 12 amostras de swabs nasais de suínos infetados com sinais clínicos (têm secreção nasal clara), fazer 3 pools de 4 amostras cada e analisar por PCR.
• Sequenciar uma amostra de PCR positiva para determinar melhor o cluster/clado.

Determinação do tempo de exposição e possível necessidade de vacinação:

• Coletar amostras de 10 a 15 suínos. Duas abordagens para a coleta:
• • Transversal – coleta de diferentes faixas etárias ao mesmo tempo (obtém resultados mais rapidamente).
  • Longitudinal – coleta dos mesmos suínos ao longo do tempo (são obtidos resultados mais precisos).
• Análise de amostras de soro por ELISA.
• Coletar 2-4 amostras de fluido oral do grupo e analisar por PCR.
• Sequenciar uma amostra positiva de PCR de cada faixa etária para determinar melhor o cluster/clado.