Teste ELISA como ferramenta de diagnóstico (2/2): Interpretando os resultados

Considerações ao interpretar os resultados:

• Os suínos expostos a um patógeno (campo ou vacina) levam tempo para produzir anticorpos suficientes para serem detectados por ELISA (geralmente pelo menos 2-4 semanas após a exposição, dependendo do patógeno e do anticorpo que estamos procurando).
• Os testes de anticorpos ELISA não podem diferenciar entre anticorpos maternos (passivos) e aqueles causados ​​pela exposição (ativos).
• Os testes de ELISA de anticorpos geralmente são incapazes de diferenciar os anticorpos produzidos por uma vacina daqueles produzidos pela exposição a uma cepa de campo.
• Em alguns casos, podem ser desenvolvidos testes especiais de ELISA, que permitem diferenciar animais infectados de vacinados (se forem utilizadas vacinas DIVA).
• Os resultados de ELISA de anticorpos não implicam proteção. A proteção pode vir de diferentes anticorpos, que não são necessariamente os medidos no teste, ou por imunidade mediada por células, que é completamente diferente da imunidade humoral ou mediada por anticorpos, e não é medida por um teste de ELISA.
• ELISA de antígeno é significativamente menos sensível (baixa sensibilidade analítica) na detecção de antígenos em comparação com PCR. A PCR replica ativamente o DNA/RNA presente, de modo que pode detectar um número extremamente baixo de vírus ou bactérias. Por outro lado, o teste ELISA requer uma concentração significativamente maior de vírus ou bactérias para poder criar uma mudança de cor detectável.
• Quando são usados ​​ELISAs comerciais (fáceis de encontrar e usar), os resultados são padronizados e geralmente consistentes entre os laboratórios. Os testes ELISA criados internamente podem produzir uma ampla variabilidade de resultados, a menos que seu protocolo de produção seja altamente padronizado e seguido rigorosamente.
• Nem todos os patógenos produzem uma resposta imune que pode ser medida.
• Normalmente, cada kit ELISA testa proteínas diferentes, que podem produzir resultados muito diferentes para a mesma amostra. Um exemplo claro são as grandes diferenças nos kits para detectar anticorpos contra Mycoplasma hyopnemoniae; Obviamente, nem todos os kits são criados iguais.
• A dose e/ou via de exposição pode afetar o nível da resposta imune (nível de produção de anticorpos).
• É importante conhecer a sensibilidade do teste (capacidade de detectar verdadeiros positivos) e sua especificidade (capacidade de identificar verdadeiros negativos como negativos; sem reações cruzadas).
• Podem ocorrer falsos positivos e falsos negativos porque a quantidade de exposição e resposta imune a patógenos varia entre suínos individuais (distribuição normal) e muitas vezes há fundo ou reatividade cruzada que não pode ser completamente eliminada (veja a figura 1).
• Os anticorpos geralmente estão presentes/detectáveis ​​por vários meses após a exposição/vacinação.

Resultados negativos

• Amostra/granja verdadeiramente negativa para o patógeno (sem exposição ou vacina).
• A amostragem da granja é realmente negativa para o patógeno, embora os animais possam ter sido vacinados (se o teste tiver capacidade DIVA) (somente em testes de anticorpos ELISA).
• Não há antígeno suficiente presente na amostra para sua detecção (somente em testes ELISA de antígeno).
• A amostra foi coletada muito cedo e o suíno ainda não conseguiu desenvolver uma resposta imune (somente em testes de anticorpos ELISA).
  • geralmente requer 7-10 dias para soroconversão.
  • Lawsonia intracellularis geralmente requer 4-6 semanas para soroconversão, dependendo da dose de exposição.
• A amostra foi coletada tarde demais e o patógeno não está mais presente.
  • O vírus da gripe está presente apenas nas secreções nasais nos primeiros 3-4 dias.
• Estamos procurando o anticorpo/antígeno errado.
  • Diferentes cepas de influenza (diferenças entre H1N1 e H3N3 e também entre diferentes linhagens de H1N1).
• Baixa prevalência na granja e o animal amostrado foi negativo.
  • Aumentar o número de animais amostrados.
• Uma doença em particular pode não estimular anticorpos suficientes para detecção.
  • Mycoplasma hyopneumoniae se adere principalmente aos cílios pulmonares e não estimula a produção elevada de IgG sérica.
    • Uma infecção de campo recente produz resultados ELISA muito mais fortes.
  • As vacinas contra Mycoplasma hyopneumoniae não estimulam uma resposta imune IgG forte.
    • Diferentes testes ELISA detectam vacinas de forma diferente.
    • Normalmente, apenas 30% dos animais vacinados soroconvertem.
• Uma amostra fracamente positiva será diluída se combinada com outras.
  • É altamente recomendável NÃO agrupar amostras!

Amostra positiva

• Amostra/granja realmente positiva para exposição a patógenos.
• Não é possível diferenciar se a amostra é infecciosa ou não infecciosa.
• Incapaz de diferenciar anticorpos maternos de exposição natural ou vacinação.
  • A maioria dos anticorpos maternos desaparece por volta das 8-12 semanas de idade.
  • À medida que os suínos envelhecem, os valores de ELISA devem ser significativamente reduzidos.
  • Testes em série podem ser feitos para confirmar o desaparecimento de anticorpos maternos, bem como a falta de exposição a cepas de campo (sem novas infecções).
• Dependendo de qual patógeno estamos procurando, a detecção da proteína (antígeno/anticorpo) nem sempre confirma a doença.
  • O soro com resultado positivo para circovírus suíno tipo 2 (PCV2) pelo anticorpo ELISA confirma a exposição ao PCV2, seja por vacinação ou infecção (ambos os casos são bastante comuns), mas não confirma se o declínio é atribuível ao PCV2 ou se houve um falha vacinal. A imunohistopatologia do tecido pulmonar e/ou linfóide é necessária para demonstrar a doença associada ao PCV2.
  • O teste pode não ser capaz de diferenciar a exposição ao vírus/bactéria da vacina de uma vacina viva modificada da infecção de campo (somente ELISA de anticorpos).
    • Aplica-se a vacinas mortas e vivas modificadas.
    • É útil saber o momento em que a vacina é aplicada, embora não seja crítico, pois os animais podem permanecer positivos para algumas doenças por um longo período de tempo (muitos meses).
• As contaminações cruzadas são improváveis, pois é necessária uma grande quantidade de contaminação para produzir um resultado positivo (depende da concentração).

• É possível que, com um simples valor de ELISA, o estágio da infecção não possa ser completamente identificado (é necessário um histórico, veja a figura 2).
  • X = valor ELISA
  • Existem três momentos diferentes de um surto que podem produzir o mesmo valor de ELISA, mas a interpretação e as ações a serem tomadas seriam bem diferentes:
    • Ponto A – Infecção precoce – o surto está começando; ações podem ser tomadas.
    • Ponto B – Fim da infecção – o surto está terminando; não pode fazer muito mais.
    • Ponto C – Segundo onda – Uma segunda onda está começando. Medidas de biossegurança ou causas do ressurgimento devem ser examinadas.
  • Uma segunda amostra dos mesmos animais pode ser necessária em 10 dias - 2 semanas para concluir a determinação do estágio em que estamos (juntamente com o histórico clínico).
    • Se os resultados do segundo teste forem maiores, provavelmente estamos no ponto A.
    • Se os resultados do segundo teste forem muito maiores, provavelmente estamos no ponto C.
    • Se os resultados do segundo teste não mudarem, provavelmente estamos em uma fase de platô.
    • Se os resultados do segundo teste diminuirem, provavelmente estamos no ponto B.

• Valores S:P elevados muitas vezes podem estar associados a uma exposição mais recente.

  • Especialmente após uma segunda exposição ou uma vacinação de reforço (ver Figura 2) (somente ELISA de anticorpos).
  • É importante notar que apenas porque uma infecção é recente não implica que o patógeno ainda esteja presente (ou seja, o animal é virêmico ou bacterêmico) (somente ELISA de anticorpos).
    • Isto é especialmente verdadeiro para o vírus da Síndrome Reprodutiva e Respiratória Suína (PRRS).
      • Os suínos podem ser ELISA negativos e ainda virêmicos.
      • Os suínos podem ter altos títulos de anticorpos no ELISA e não ser virêmicos.
      • Para estabelecer o nível de viremia em animais, a PCR é usada.
• Valores S:P baixos
  • É possível que uma doença específica não esteja estimulando anticorpos suficientes para detectá-la.
    • Mycoplasma hyopneumoniae adere principalmente aos cílios pulmonares e não estimula a produção elevada de IgG sérica.
      • Uma infecção de campo recente produz resultados ELISA mais fortes.
    • As vacinas contra Mycoplasma hyopneumoniae não estimulam uma forte resposta de IgG.
      • Diferentes testes ELISA detectam vacinas de forma diferente.
      • Normalmente, apenas cerca de 30% dos animais vacinados soroconvertem.
  • Suínos tratados com antibióticos por várias semanas podem suprimir o crescimento bacteriano durante esse período, diminuindo a exposição à doença (mas não a eliminando), levando a uma resposta imune menor ou mais fraca à exposição.
    • Usar antibióticos contra Mycoplasma hyopneumoniae transição do início para o meio.
    • Usar antibióticos contra patógenos entéricos como Lawsonia intracellularis transição inicial ou intermediária.