Teste ELISA como ferramenta de diagnóstico (1/2): Princípios básicos

A utilização do ensaio imunoenzimático (ELISA) para a detecção de proteínas (antígenos ou anticorpos) é uma das ferramentas mais prontamente disponíveis em todo o mundo e atualmente é amplamente utilizada na suinocultura. O teste é comumente usado na vigilância e monitoramento de doenças, bem como uma ferramenta de diagnóstico. Por ser amplamente utilizado por veterinários de suínos, é essencial entender como funciona, o que detecta e suas vantagens ou desvantagens na interpretação dos resultados. Também é importante lembrar que, embora a mesma tecnologia seja usada contra diferentes patógenos, os resultados devem ser interpretados de maneiras diferentes.

Informações do teste

Os testes ELISA são projetados para a detecção de antígenos ou anticorpos contra bactérias ou vírus. Os antígenos são proteínas estranhas ao corpo que estimulam a produção de anticorpos (em inglês significa "gerador de anticorpos": antígeno = antibody generator). Ao pensar em anticorpos, devemos ter em mente que eles são sempre contra proteínas. Ao projetar o ensaio, o fabricante ou laboratório decide qual proteína específica, ou proteínas, será alvo. Se o ELISA tem como alvo uma proteína diretamente na bactéria ou vírus, é chamado de ELISA de antígenos, enquanto que, se o objetivo for a resposta de anticorpos do animal contra a bactéria ou vírus, é conhecido como anticorpo ELISA. Embora existam ensaios ELISA projetados para atingir apenas uma ou duas proteínas (anticorpos ou antígenos), muitos visam um grande número de proteínas. Os ensaios também podem ser projetados para detectar um tipo específico de resposta de anticorpos (IgG, IgM ou IgA) ou uma combinação deles. Cada um desses tipos de anticorpos tem funções específicas que estão além do escopo deste artigo.

O conceito e o processo de detecção de anticorpos ou antígenos por ELISA são exatamente os mesmos. Você começa obtendo a proteína alvo (antígeno ou anticorpo). Para proteínas individuais, é necessário um processo separado para obter uma concentração purificada dessa proteína em particular. Identificar qual proteína ou proteínas visar é um processo científico e complexo. Idealmente, o ensaio tem como alvo uma única proteína que é exclusiva do patógeno de interesse (não reage de forma cruzada com outros patógenos), é altamente imunogênica (para detecção de anticorpos) ou é encontrada em altas concentrações (para detecção de antígeno); ele tem como alvo uma proteína que é conhecida por estar altamente correlacionada com a proteção contra doenças e sempre estará presente. Infelizmente, a maioria desses critérios é desconhecida e é usada uma única proteína, que pode ser facilmente produzida e encontrada na amostra, ou uma mistura de várias proteínas (vírus inteiros ou bactérias). Embora o uso de vírus ou bactérias inteiros possa ser fácil, eles são mais propensos a reagir de forma cruzada com outros patógenos.

Passos gerais do processo (ver figura 1).

• Passo 1. Os micropoços são pré-revestidos com antígeno(s) alvo (para detectar anticorpos) ou anticorpos (para detectar antígenos).
• Passo 2. As amostras a serem analisadas são adicionadas e incubadas para permitir a ligação entre os antígenos e os anticorpos.
• Passo 3. A amostra é removida e são adicionados anticorpos especiais que irão aderir ao lado oposto dos anticorpos (parte inferior do “Y” do anticorpo na detecção de anticorpos) ou dos antígenos (parte superior do “Y” na detecção de anticorpos). A amostra é então incubada para permitir a ligação e lavada para garantir que anticorpos ou antígenos não aderentes (ou seja, não-alvo) sejam removidos.
• Passo 4. O anticorpo marcado é adicionado com um detector que emite fluorescência e vai aderir aos anticorpos especiais da etapa 3 (fixar na parte inferior do “Y” no anticorpo; é o mesmo alvo para detecção de antígeno e alvo). Nesse momento, a amostra é incubada novamente para permitir a ligação e lavada novamente para garantir que quaisquer anticorpos marcados que não tenham aderido sejam removidos.
• Passo 5. O reagente que irá desencadear a fluorescência dos anticorpos marcados anexados é adicionado e depois incubado para garantir a ligação.
• Passo 6. A amostra é lida, geralmente usando uma máquina especial calibrada em um comprimento de onda específico para quantificar a mudança de cor (referida como absorbância). Existem algumas pequenas variações neste processo, dependendo se é um ELISA direto, indireto ou sanduíche; cada tipo tem suas vantagens e desvantagens (que não expomos aqui) mas, no final, todos obtêm os mesmos resultados; quanto maior a absorbância, ou mudança de cor, maior a concentração esperada do antígeno ou anticorpo alvo na amostra testada.

No caso de um ELISA competitivo, o ponto chave é que o processo utilizado irá, de fato, produzir o resultado oposto (veja a Figura 2B). A amostra e uma quantidade conhecida de antígeno marcado (para detecção de antígeno) ou anticorpos (para detecção de anticorpos) são adicionados à amostra a ser testada para que, uma vez adicionados aos poços marcados, tanto a amostra original quanto as proteínas marcadas que temos adicionados (anticorpos ou antígenos) competem para se fixar ao poço previamente revestido. Em suma, se não houver proteínas alvo na amostra a ser testada, todas as proteínas marcadas poderão se ligar ao poço, gerando uma forte mudança de cor. Por outro lado, se houver um número considerável de proteínas-alvo na amostra, elas competirão (bloquearão) as proteínas marcadas pela ligação. Quando a amostra é lavada, todas as proteínas marcadas que não se ligaram serão removidas. Portanto, quanto mais anticorpos ou antígenos houver na amostra, mais eles impedirão que as proteínas marcadas se liguem, sendo eliminadas na lavagem. Isso implica uma baixa absorbância quando a concentração da proteína alvo na amostra é alta, o que é o oposto do caso anterior. Valores altos sugerem uma concentração baixa ou amostra negativa e impossibilitam a quantificação da concentração de antígeno/anticorpo de amostras positivas.

O ponto de corte para cada teste ELISA pode ser diferente e é predefinido pelo fabricante com base na sensibilidade e especificidade desejadas. Para ELISAs diretos, indiretos ou sanduíche, qualquer número acima do ponto de corte é considerado positivo. Para um ELISA competitivo, qualquer número acima do ponto de corte é considerado negativo. Em alguns testes, é estabelecida uma zona cinzenta para classificar as amostras como “suspeitas”, pois o teste tende a ter algumas reações “de fundo” (reações cruzadas) que dificultam um ponto de corte claro.

Os resultados são geralmente, mas nem sempre, exibidos como um S:P corrigido ou porcentagem de positividade em relação ao controle positivo corrigido para mudança de cor de fundo em poços de controle negativo. Os níveis de anticorpos são frequentemente chamados de "títulos". Embora não seja tecnicamente correto, pode ser justificado em uma perspectiva geral. Um ponto chave é que quando se fala em títulos existe uma relação matemática direta entre os valores (um valor de 20 tem o dobro de anticorpos que uma amostra com valor de 10). Com valores ELISA, essa relação matemática direta não existe (veja a Figura 2A). Um ELISA de 2.0 tem significativamente mais anticorpos do que um de 1.0 e não apenas o dobro.

Agrupamento de amostras para análise

Como os testes ELISA são dependentes da concentração (eles se correlacionam diretamente com a concentração da proteína alvo [anticorpo ou antígeno]), o agrupamento de amostras não é recomendado. Ao agrupá-los, você pode aumentar significativamente a probabilidade de perder uma amostra positiva.

Alguns usos do teste ELISA:

• Detectar a presença de anticorpos contra patógenos específicos – Antibody ELISA – É o uso mais comum.
• Determinar a exposição a um patógeno.
• Determinar o estado de vacinação de um animal.
• Determinar o tempo de infecção (mudança no nível de anticorpos) ao longo do tempo.
• Detectar a presença de um patógeno alvo através da detecção de proteína/antígeno do patógeno alvo – antígeno ELISA.