O teste PCR como ferramenta de diagnóstico (2/2): Usos e interpretação dos resultados

Algumas utilizações do teste de PCR:

• Detectar a presença de DNA/RNA de um determinado patógeno – uso mais comum.
• Sorotipagem de um patógeno para genes específicos (DNA/RNA) que são conhecidos por variar entre os sorotipos (por exemplo, genes de biossíntese de cápsula para Actinobacillus pleuropneumoniae).
• Detectar a presença de genes de virulência (por exemplo, genotipagem de E. coli).

É importante lembrar que a PCR apenas detecta a presença de material genético específico com base nos primers e não indica se o organismo pode ou não ser infeccioso. Quando os genes são analisados, o teste detecta apenas a presença do gene, mas não confirma se o organismo está expressando o fator de virulência detectado.

Nos últimos anos, os laboratórios desenvolveram PCR multiplex para analisar vários patógenos ou várias cepas ou genes do mesmo patógeno ao mesmo tempo. Esses PCRs multiplex são vários PCRs em execução ao mesmo tempo. O seu custo é superior ao de uma PCR individual, mas muito inferior à realização de várias PCRs separadamente.

O laboratório utilizará diferentes marcadores para identificar quais resultados positivos correspondem a cada primer. Muitas vezes essas PCRs multiplex são muito úteis, como na genotipagem de E. coli onde cerca de 14 genes podem ser analisados ​​ao mesmo isolado bacteriano ao mesmo tempo. Outros exemplos são a análise simultânea para PRRS tipo 1 e tipo 2 ou para diarreia epidêmica suína e coronavírus delta suíno.

É essencial ter em mente que o desenvolvimento desses testes nem sempre é fácil, pois o laboratório deve garantir que não haja interferência entre os diferentes PCRs. Ou seja, as temperaturas de ciclagem e os diferentes primers usados ​​não inibem ou reagem de forma cruzada entre si. Cada uma dessas PCRs multiplex deve ser validada antes do uso e produzir uma otimização significativa do teste.

Considerações com a interpretação dos resultados:

Um dos maiores desafios da PCR é que cada laboratório geralmente possui um protocolo diferente para análise de amostras, o que pode levar a diferenças no processo de extração de DNA/RNA, protocolos de ciclagem, bem como nos primers utilizados. Isso pode dificultar a comparação de resultados obtidos em diferentes laboratórios.

Resultado negativo

• Amostra/granja negativa verdadeira para o patógeno.
• Certifique-se de enviar as amostras apropriadas para determinação do patógeno em questão. Alguns exemplos típicos a serem considerados:
  • O vírus da gripe não se torna sistêmico, por isso não será encontrado em amostras de sangue.
  • O teste para Mycoplasma hyopneumoniae em amostras de fluido oral raramente fornece um resultado positivo, pois o patógeno normalmente se liga aos cílios no sistema respiratório inferior.
  • Enviar apenas um feto abortado por PRRS pressupõe apenas 50% de chance de ser positivo. Pelo menos 4 fetos devem ser submetidos para maximizar as chances de encontrar uma amostra positiva.
  • Amostra coletada muito tarde no curso da doença pode ser que o patógeno não esteja mais presente.
    • O vírus da gripe é encontrado nas secreções nasais apenas nos primeiros 3-4 dias.
• Incompatibilidade de primer.
  • Nova cepa de PRRS.
• Baixa prevalência em animais amostrados de granja e não infectados.
  • É necessário aumentar significativamente o número de animais amostrados.
• Diluição de uma amostra positiva fraca devido ao agrupamento.
  • Agrupamento de fluidos orais que geralmente são amostras já diluídas (teste em vários suínos e altos valores de Ct já esperados em amostras positivas).

Resultado positivo

• Amostra/granja realmente positiva para o patógeno.
• Não distingue se a amostra é infecciosa ou não.
• Dependendo do patógeno, a detecção de DNA/RNA nem sempre confirma a doença.
  • O tecido pulmonar PCR positivo para Mycoplasma hyopneumoniae confirma a presença do organismo no tecido, mas não a gravidade ou importância clínica do patógeno. Na maioria das granjas (exceto granjas negativas para Mycoplasma), é necessário confirmar visualmente a porcentagem de dano pulmonar (avaliação) para determinar o significado clínico dos achados.
  • O soro PCR positivo para circovírus suíno tipo 2 (PCV2) confirma a presença de PCV2, mas não se a perda ou pneumonia é atribuível ao PCV2 ou se houve falha na vacina. A imunohistopatologia do tecido pulmonar e/ou linfóide é necessária para demonstrar a doença associada ao PCV2.
  • O teste não distingue entre vírus/bactérias de vacina viva modificada e infecção de campo.
    • É importante saber o tempo e o tipo de vacina utilizada.
    • Informações de sequenciamento podem ser necessárias.
• Contaminação cruzada se as amostras não forem manuseadas corretamente.
  • Especialmente ao agrupar amostras. O pool deve ser feito sob uma cobertura de laboratório.
  • Amostras fecais coletadas do solo podem ficar contaminadas com restos ambientais do patógeno.
• Valores baixos de Ct estão associados a uma alta concentração de vírus/bactéria na amostra e muitas vezes podem se correlacionar com uma maior probabilidade de doença clínica.
  • Valores baixos de Ct de Lawsonia intracellularis nas fezes possivelmente estão mais relacionados a lesões intestinais.
    • Ct < 20 → Enteropatia proliferativa suína.
    • Ct > 30 → Nenhuma lesão intestinal detectada.

Genotipagem

• O uso de genotipagem por PCR tornou-se mais comum, especialmente para E. coli. Fornece informações epidemiológicas sobre mudanças nas cepas que afetam a granja (por exemplo, influenza H1N1 vs H3N2).
• Os resultados da genotipagem são frequentemente usados ​​para selecionar a vacina a ser usada, como com E. coli (confirmação de pili).
• É importante lembrar que os resultados representam apenas uma única cepa e os suínos são frequentemente infectados com várias cepas ao mesmo tempo.
• A detecção apenas confirma a presença de genes de virulência, mas não sua expressão. Muitas vezes basta saber se tem potencial genético para expressar o gene.
• À medida que o custo diminui e a facilidade do sequenciamento de genes continuam, o uso ou a necessidade de genotipagem por PCR diminuirá.