Teste de PCR como ferramenta de diagnóstico (1/2): Princípios básicos

A reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma das ferramentas de diagnóstico mais comuns usadas pelos veterinários de produção de suínos atualmente. É usada não apenas para fins de diagnóstico, mas também para melhorar a biossegurança por meio da vigilância e controle de doenças. Como tal, é fundamental compreender as vantagens e desvantagens de tal tecnologia na interpretação dos resultados. Também é importante lembrar que mesmo que a mesma tecnologia seja usada para diferentes patógenos, deve haver diferenças na interpretação desses resultados.

Informação do teste

PCR é projetado para a detecção de material genético (DNA ou RNA) de bactérias ou vírus. O processo começa com a extração do DNA ou RNA da amostra, que é posteriormente submetida a ciclos de amplificação térmica. Se o material extraído for RNA, o primeiro passo será converter o RNA em DNA (tecnicamente conhecido como DNA complementar ou cDNA). Os ciclos térmicos consistem em um processo de 3 etapas: 1) desnaturação, 2) alinhamento e 3) extensão, em que se obtém como resultado a duplicação do DNA presente na amostra. Portanto, para cada ciclo (1 Ct), assumindo 100% de eficiência, o dobro de DNA estará presente. O objetivo é continuar o processo de amplificação até que DNA suficiente seja detectado para tornar a amostra positiva ou até 30-40 ciclos, dependendo do projeto de teste específico usado.

O processo de extração é uma etapa crítica do teste de PCR, pois afeta a quantidade e a qualidade do material genético na amostra analisada. É essencial utilizar o processo de extração apropriado para o tipo de amostra a ser analisada (soro, fluidos orais, tecido, etc). A etapa 2 do processo de amplificação (alinhamento) requer o uso de primers, que são pequenos pedaços de sequência de DNA projetados especificamente para se ligar e ajudar a replicar a sequência genética específica do patógeno em questão. Para patógenos que estão em constante evolução genética (como o vírus PRRS), esses primers precisam ser atualizados regularmente para garantir que novas cepas continuem a ser detectadas.

O limiar do ciclo de teste (geralmente em torno de 30-40) é estabelecido determinando que, se o processo de amplificação continuasse, o teste seria positivo devido ao alinhamento e extensão espontâneos. Isso sugere que resultados positivos fracos, com altos valores de Ct perto do limite, é necessária uma consideração especial na interpretação dos resultados, especialmente no final de um surto.

Existem dois usos diferentes dos testes de PCR: a tradicional PCR em gel e a mais moderna PCR em tempo real. Ambos os testes funcionam da mesma forma, com base na amplificação de DNA ou RNA. A diferença é que o gel PCR é "lido" apenas uma vez no final do teste, enquanto os resultados do teste de PCR em tempo real são "lidos" após cada ciclo. A vantagem da PCR em tempo real é que ela permite a obtenção de resultados quantitativos/semiquantitativos.

Agrupamento de amostras para análise

Os testes de PCR têm uma grande capacidade de detectar pequenas quantidades de material genético em amostras (sensibilidade analítica) graças ao processo de amplificação, que oferece a possibilidade de analisar várias amostras com um único teste (pool). É importante lembrar que o agrupamento, por definição, diluirá a amostra analisada. Isso não deve ser um problema quando a concentração esperada de um determinado patógeno é alta (especialmente no início do surto da doença). No entanto, o agrupamento pode ser um problema quando a concentração do patógeno em uma amostra positiva é baixa, como no final de um surto de doença ou em um tipo de amostra que deve ser diluída (fluidos orais).